[发明专利]荧光定量PCR检测巨细胞病毒gH基因分型试剂盒及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及定量PCR检测试剂盒，具体涉及利用实时荧光定量PCR检测巨细胞病毒的包膜糖蛋白H基因（glycoprotein H, gH）分型的试剂盒。

背景技术

人巨细胞病毒( human cytomegalovirus, HCMV)感染在免疫功能低下人群尤其是幼儿、 AIDS 病人以及器官移植受者中可引起严重疾病, 甚至导致患者死亡。HCMV gH 基因来自ORF UL75,gH 糖蛋白为由742-743个氨基酸组成的单链结构,携带N-糖基,分子量86 KD。gH糖蛋白可以和gL蛋白、gO 蛋白形成gcIII复合体，gcIII复合体进一步表达于受感染的细胞膜表面。gH 糖蛋白表现出了较强的抗原性，也是诱导机体产生免疫应答的主要靶位点。1992年chou等最先提出了HCMV gH 基因 N末端存在核苷酸序列差异, 分析这些位点可将 HCMV临床分离株分为2个基因型（gH1和gH2）。同时，其通过序列比对提出了鉴别两个基因型的方法：利用巢式PCR法经两步PCR扩增出gH 基因两个分型的不同区域（288bp），之后利用Hha Ⅰ进行酶切分析，可以被HhaⅠ切开的为gH1型，不可以被HhaⅠ切开的为gH2型。此方法用于鉴别HCMV gH 基因分型一直被沿用至今。之后多个研究表明gH1分型与gH2分型的巨细胞病毒引起的疾病种类及某些疾病临床的严重程度有差异，可见巨细胞病毒的gH分型对临床疾病的诊治具有重要的指导意义。但此前的鉴别方法须经两步PCR扩增才能得到足够的产物，之后对此产物还需进行纯化回收（液体回收或凝胶电泳后割胶回收），回收后的产物还需利用HhaⅠ进行酶切反应，酶切反应后的产物须凝胶电泳后进行相关DNA条带的分析才能最终确定HCMV的具体gH基因的分型。此方法耗时耗力，且耗费成本，所以巨细胞病毒的gH分型仅停留在实验室的科研中，无法应用于临床常规检测。这就迫使我们寻找更简便快捷，且特异敏感的方法去满足临床检测和鉴定HCMV gH 基因分型的需求，为临床巨细胞病毒感染的诊治提供技术手段。

近几年兴起的荧光PCR技术具有准确性高，重复性好等特点，已广泛用于基因表达研究、病原体检测及基因分型等医学研究领域中。该方法完全闭管检测，避免了交叉污染，且结果判断由计算机完成，简化了操作步骤，加强了结果的可靠性。多种Taqman荧光探针的应用及荧光定量PCR仪的发展，使利用多通道荧光定量PCR仪进行实时巨细胞病毒gH分型的检测及鉴别成为可能。

本发明运用实时荧光PCR技术，采用巨细胞病毒通用引物和gH分型的特异荧光探针，开发研制用于巨细胞病毒gH基因快速分型的试剂盒。并通过对临床上的巨细胞病毒感染患儿的尿液标本，咽拭子标本，痰液标本等标本进行检测分型，旨在为临床上的巨细胞病毒进行快速准确的gH基因型分型的鉴定，同时为临床上不同gH型别的巨细胞病毒感染和疾病发生发展的关系提供实验手段及实验依据。

发明内容

本发明的目的是提供一种实时荧光定量PCR检测巨细胞病毒gH基因分型试剂盒，是一种双探针实时荧光定量PCR检测巨细胞病毒gH基因分型试剂盒，由定量PCR反应液、gH1型标准品、gH2型标准品、阳性对照品、阴性对照品、病毒DNA抽提裂解液、操作说明书、盒体组成，盒体设有容器孔，分别放置PCR反应液管、gH1型标准品管、gH2型标准品管、阳性对照品管、阴性对照品管、病毒DNA抽提裂解液管，定量PCR反应液管装有PCR缓冲液、Mgcl₂、dNTPs、巨细胞病毒gH基因通用上游引物，巨细胞病毒gH基因通用下游游引物、荧光探针、Taq DNA聚合酶。其中：

上游引物序列为：5’-TGTTTTCACGCAGGAAGCGG-3’，

下游引物序列为：5’-TGGATCACGCCGCTGAACC-3’，

gH1型探针为：5’-FAM-CATCCGAAGCGCTGGACCCTCACG-BHQ1-3’，

gH2型探针为：5’-HEX-TATCCGAACCGCTGGACAAAGCG-BHQ1-3’。

gH1型标准品序列为：