[发明专利]一种组织匀浆法分离活细胞构建细胞库的方法

说明书

技术领域

本发明涉及胎儿附属物组织细胞库的构建方法，更具体地说是一种从胎儿附属物组织分离细胞构建细胞(团)库的物理方法。

背景技术

胎儿附属物组织主要由胎盘小叶、胎盘底座、基蜕膜、羊膜和脐带组织构成。起源于胚胎发育期胚外中胚层的胎盘是由间质、血管及滋养细胞组成，是胎儿最早期的造血器官，含有大量的间质成分。最新的研究表明胎盘中含有间充质干细胞、胎盘亚全能干细胞和丰富的造血干细胞，从胎盘中分离培养出这些多能干细胞将为实验研究和临床应用开辟一个崭新而丰富的来源。

胎盘亚全能干细胞来源于胎盘组织，自胚胎形成的第5到7天开始出现，能分化形成200多种人体组织器官细胞，但不能形成一个完整的人体。具备多能干细胞的许多生物学特征，该细胞体外可向脂肪细胞、成骨细胞、神经细胞、肝上皮样细胞等定向分化。

胎盘造血干细胞是存在于胎盘组织中的一群原始造血细胞，是血细胞(红细胞、白细胞、血小板等)的始祖，是高度未分化细胞，也可以说它是一切血细胞(其中大多数是免疫细胞)的原始细胞。胎盘组织中造血干细胞的含量是脐带血中造血干细胞含量的5-10倍，足可供小孩自用几次，或提供给1-2个成人患者的治疗。同时有效解决了移植时骨髓或动员后外周血来源不足，脐带血数量不够等技术难题，将有望取代骨髓、动员后外周血和脐带血用于造血干细胞移植。

基蜕膜是母亲妊娠时胚泡的滋养层细胞一经与子宫内膜接触，引起其附近的内膜间质细胞肥大增殖形成的组织。基蜕膜形成胎盘隔将丛密绒毛膜分隔成若干个绒毛小叶，其中含有母亲源的基蜕膜干细胞。

羊膜(amnion)是覆盖在羊膜腔内表面的一层薄膜，从细胞滋养层演化而来，是人类两层胎膜的内层，其厚度为0.02～0.05mm，是人体中最厚的基底膜，由羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cell，HAEC)、基底膜、实质层、纤维母细胞层、海绵层5层结构组成。人羊膜上皮细胞位于羊膜的最内层，羊膜上皮细胞在受精后第8天从外胚叶发育而来，使其可能维持原肠胚形成前期胚胎干细胞的可塑性，在治疗中枢神经障碍方面具有独特的应用价值：1996年，Sakuragawa等最先发现培养的人羊膜上皮细胞表达神经元和神经胶质细胞的标志。随后的研究表明，培养的人羊膜上皮细胞能合成和释放神经递质如乙酰胆碱，儿茶酚胺和多巴胺。人羊膜上皮细胞移植治疗大鼠帕金森病(PD)的实验表明其在体内不仅能存活并表达络氨酸羟化酶(TH)活性，而且可以逆转病情和防止神经元死亡。人羊膜上皮细胞对于灵长类的脊髓损伤同样具有良好的治疗效果。

脐带是胎儿和母体连接的纽带。脐带内有三根血管通过，一根静脉和二根动脉，起着沟通母子间血液循环的作用。足月胎儿的脐带长约30～70厘米。脐带华通氏胶(Wharton’s Jelly)中的干细胞主要是脐带间充质干细胞。

间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)是一种多能干细胞，在胚胎发育中来源于中胚层。在机体正常的组织损伤修复过程中，MSC是一种重要的参与组织再生的细胞。在组织损伤引起的特殊信号作用下，MSC迁移到受损部位，在局部聚集增殖，依据不同的损伤信号沿着不同途径分化。MSC易于分离扩增，体外倍增能力旺盛，即使扩增1亿倍仍能保持其多向分化能力。因此，MSC是一种实用的组织修复种子细胞。

MSC具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下具有分化为：上皮干细胞、神经干细胞、肝干细胞，肌细胞、成骨细胞、软骨细胞、基质细胞等多种细胞的能力。可以用来修复受损或病变的组织器官，治疗心、脑血管疾病、神经系统疾病、肝脏疾病、骨组织病、角膜损伤、烧伤烫伤、肌病等多种疾病;并且，MSC具有免疫调节作用，通过负性免疫调节功能，抑制机体亢进的免疫反应，使机体免疫功能恢复平衡，从而可以用来治疗造血干细胞移植之后的免疫排斥反应以及克隆氏病、红斑狼疮，硬皮病等自身免疫系统疾病；MSC还是人体微环境的重要组成部分，移植间充质干细胞可以改变造血微环境，重建免疫系统，促进造血功能恢复，与造血干细胞共移植能显著提高白血病和难治性贫血等的治疗效果。

胎儿附属物细胞库的构建，将原来作为医疗废弃物直接处理掉的新生儿的脐带和胎盘组织通过处理，提取其中丰富的干细胞资源，并通过成熟的深低温冷冻技术使之在休眠状态下长时间储存，作为一种宝贵的生物资源储备，将来，可以应用于许多自体重大疾病的治疗;同时，也可以用于异体的移植与治疗；还可以通过再研发和处理，开发成干细胞药物，造福全社会。