[发明专利]PCR直接测序法对汉坦病毒进行基因分型的引物及试剂盒和方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因诊断技术领域，尤其涉及一种PCR直接测序法对汉坦病毒进行基因分型的引物及试剂盒和方法。

背景技术

汉坦病毒（Hanta virus，HV）属布尼亚病毒科的汉坦病毒属是一种有包膜分节段的负链RNA病毒，包括引起汉坦病毒肾综合征出血热（HFRS）的汉坦型、汉城型、普马拉型等，以及引起汉坦病毒肺综合征（HPS）的纽约型、无名型等，在我国以汉坦型和汉城型为主要流行株。汉坦病毒的自然宿主主要是小型啮齿动物，并经由啮齿类动物传播给人类，引起HFRS或HPS等。

汉坦病毒感染又称出血热，是重要的烈性人兽共患病原，被国家国卫生部和农业部列为二类危害病原。实验动物高度易感，近年来，实验动物汉坦病毒感染人事件的频发已成为危害科研人员健康和实验动物业发展的重要因素。

自上世纪60年代到90年代先后发生30余起实验室内大鼠感染流行性出血热事件，共导致50余名科研人员发病。2000～2001年间，在对杭州市多家科研和教学单位的实验动物相关工作人员血清人兽共患病病原抗体的检测中发现，家鼠型肾综合征出血热病毒和弓形虫抗体均有阳性病例，表明实验动物密切接触者时刻存在着感染人兽共患病病原风险。

从事实验动物大小鼠生产及科学研究人员由于经常接触携带HV的宿主动物及其排泄物、污染的尘埃等而受感染，由于汉坦病毒引发疾病的类型及其严重程度取决于病毒的型别，对汉坦病毒株的分型，以及阐明病毒之间的关系对汉坦病毒病原防治具有重要的意义。

采用血清学方法虽然能对病毒进行分类，但血清学分型的实验周期长，工作量大，得到病毒分离物较为困难无法进行血清学分型，而且不能阐明病毒之间的系统发生关系。基于病毒基因的序列数据分析不但能对病毒进行基因分型，还能较好地阐明病毒之间的系统发生关系。

已有研究表明，依据M基因片段和S基因片段的全长核苷酸序列构建系统发生树，对汉坦病毒进行基因分型的结果与血清学分型结果一致，但需对整个基因进行全核苷酸测序分析，目前尚无文献报道仅用一次PCR产物的直接测序结果实现汉坦病毒不同毒株的基因分型。

发明内容

本发明提供了一对引物，利用该引物可以一次特异性扩增汉坦病毒S片段的目标序列，利用该目标序列能准确对汉坦病毒进行基因分型。

一对引物，包括：

上游引物：ATTAGCCCWGTCATGAGTGT；

下游引物：CTTTGACTCYTTTGKYTCCA；

其中Y为C或T，W为A或T，K为G或T。

该引物是基于Genbank上公开的24株汉坦病毒代表株的S基因片段序列设计的，利用该引物只需进行一次PCR扩增，获得的扩增产物即可用于对待测病毒样本的基因分型。

具体地，利用所述引物对汉坦病毒进行基因分型的方法包括：

（1）提取待测病毒样本的总RNA，逆转录获得cDNA；

（2）以所述cDNA为模板，利用所述引物进行PCR扩增，并对扩增的目的片段进行测序；

（3）基于目的片段的序列信息并以已知基因型代表毒株的相应片段为参照构建系统发生树；

（4）根据系统发生树对待测病毒样本进行基因分型。

为保证测序数据的准确性，作为优选，步骤（2）中，采用双向测序法对扩增的目的片段进行测序，测序完成后进行序列拼接。目的片段的长度在200bp左右，单向测序可完全测通但只有一次覆盖，若采用的双向测序法进行测序，则每个扩增产物即可有两次覆盖。测序完成后对双向测序得到的两条序列进行合并，即得到一条高质量序列。

作为优选，步骤（3）中，利用邻位相连法构建系统发生树。邻位相连法（NJ法）通过确定距离最近的成对分类单位使系统发生树的总距离达到最小，通过循序地将相邻点合并成新的点，从而建立起一个相应的拓扑树。与其他方法相比，利用邻位相连法构建的系统发生树，其基因分型结果更为准确。