[发明专利]一种新型高效的羊毛硫细菌素cerecidin及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种新型高效的羊毛硫细菌素cerecidin及其应用。

背景技术

羊毛硫细菌素是一种由革兰氏阳性菌（如乳酸菌）产生的，通过核糖体合成并经过翻译后修饰形成的具有生物活性的抗菌肽。它们被认为是潜在的抗生素替代物，对特定的革兰氏阳性致病菌尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐万古霉素粪肠球菌或新青霉素抗性菌具有较强的抑菌活性。作为目前研究的最为清楚的羊毛硫细菌素，nisin由于其具有优良的抑菌活性，已经作为一个天然的安全的食品防腐剂广泛应用于世界上80多个国家，并且在其使用的40余年中未引起严重的细菌耐药反应，应用效果理想。但nisin本身在抗逆性方面存在一些不足，如只在低pH条件下（pH<7）稳定以及耐高温性（大于100℃）较差。新型羊毛硫细菌素越来越多的被发现，目前已经报道的羊毛硫细菌素至少有50种。其中，mutacin1140、duramycin、gallidermin、lacticin3147和microbisporicin等已经处于临床前研究阶段。但目前尚无一种羊毛硫细菌素被开发成为商品化药物，一方面因为羊毛硫细菌素的抑菌谱较窄且对特定耐药菌活性较弱，另一方面因为羊毛硫细菌素的抗逆性较差。因此，开发新的具有更高活性且抗逆性强的羊毛硫细菌素在食品及医药应用方面具有重要的研究价值。传统方法主要通过筛选具有天然产生抑菌活性物质的菌株并通过发酵获得新的羊毛硫细菌素，这种方法耗时且工作量大，并具有一定的随机性。因此，建立新的羊毛硫细菌素合成方法对于开发新的并且具有应用价值的羊毛硫细菌素具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型高效的羊毛硫细菌素cerecidin及其应用。

本发明所提供的一种羊毛硫细菌素cerecidin，是一种修饰的多肽，该多肽的结构如下：

骨架氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，其中第1位氨基酸Thr发生脱水后与第5位氨基酸Cys形成硫醚键-S-，第1位氨基酸Thr和第5位氨基酸Cys形成甲基羊毛硫氨酸Abu-S-Ala，第15位氨基酸Ser发生脱水后与第19位氨基酸Cys形成硫醚键-S-，第15位氨基酸Ser和第19位氨基酸Cys形成羊毛硫氨酸Ala-S-Ala，第1位至第5位氨基酸形成A环，第15位至第19位氨基酸形成B环，第2位氨基酸Thr与第13位氨基酸Thr发生脱水分别形成脱氢丁氨酸。

上述多肽的编码基因也属于本发明的保护范围。

上述编码基因中，所述的编码基因为如下中至少一种：

1）SEQ ID No.2中自5’末端起第172位至231位核苷酸所示的DNA分子；

2）在严格条件下与1）限定的DNA分子杂交且编码上述多肽的DNA分子；

3）与1）或2）限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码上述多肽的DNA分子。

含有上述任一所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

上述多肽在制备抑制革兰氏阳性致病菌的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述革兰氏阳性致病菌为黄色微球菌（Micrococcus flavus）和/或粪肠球菌（Enterococcus faecalis）；

和/或，所述粪肠球菌为耐万古霉素的粪肠球菌。

上述多肽在制备具有pH稳定性和/或热稳定性的抑菌多肽中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述pH稳定性指在pH值为2-12的条件下所述多肽的抑菌活性稳定；

所述热稳定性为在100℃下处理0-8h后所述多肽的抑菌活性稳定。

上述应用中，所述菌为黄色微球菌（Micrococcus flavus）和/或粪肠球菌（Enterococcus faecalis）；

和/或，所述粪肠球菌为耐万古霉素的粪肠球菌。

一种制备上述的多肽的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤：

（1）将SEQ ID No.2所示的DNA连入大肠杆菌的重组表达载体中，得到重组表达载体；将重组表达载体导入大肠杆菌中，得到重组大肠杆菌；

（2）利用所述重组大肠杆菌进行原核表达，收集菌体；

（3）将菌体破碎，离心，收集上清；

（4）将所述上清用Ni亲和柱进行纯化，收集纯化产物；

（5）将纯化产物与胰蛋白酶共孵育，37℃反应1-4h，得到反应产物；

（6）去除所述反应产物中的胰蛋白酶；