[发明专利]一种新型高效的羊毛硫细菌素cerecidin及其应用

权利要求书

1.一种羊毛硫细菌素cerecidin，是一种修饰的多肽，该多肽的结构如下：

骨架氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，其中第1位氨基酸Thr发生脱水后与第5位氨基酸Cys形成硫醚键-S-，第1位氨基酸Thr和第5位氨基酸Cys形成甲基羊毛硫氨酸Abu-S-Ala，第15位氨基酸Ser发生脱水后与第19位氨基酸Cys形成硫醚键-S-，第15位氨基酸Ser和第19位氨基酸Cys形成羊毛硫氨酸Ala-S-Ala，第1位至第5位氨基酸形成A环，第15位至第19位氨基酸形成B环，第2位氨基酸Thr与第13位氨基酸Thr发生脱水分别形成脱氢丁氨酸。

2.权利要求1所述多肽的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为如下中至少一种：

1）SEQ ID No.2中自5’末端起第172位至231位核苷酸所示的DNA分子；

2）在严格条件下与1）限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述多肽的DNA分子；

3）与1）或2）限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码权利要求1所述多肽的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.权利要求1所述的多肽在制备抑制革兰氏阳性致病菌的产品中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述革兰氏阳性致病菌为黄色微球菌（Micrococcus flavus）和/或粪肠球菌（Enterococcus faecalis）；

和/或，所述粪肠球菌为耐万古霉素的粪肠球菌。

7.权利要求1所述的多肽在制备具有pH稳定性和/或热稳定性的抑菌多肽中的应用；

所述pH稳定性指在pH值为2-12的条件下所述多肽的抑菌活性稳定；

所述热稳定性为在100℃下处理0-8h后所述多肽的抑菌活性稳定。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述菌为黄色微球菌（Micrococcus flavus）和/或粪肠球菌（Enterococcus faecalis）；

和/或，所述粪肠球菌为耐万古霉素的粪肠球菌。

9.一种制备权利要求1所述的多肽的方法，包括如下步骤：

（1）将SEQ ID No.2所示的DNA连入大肠杆菌的重组表达载体中，得到重组表达载体；将重组表达载体导入大肠杆菌中，得到重组大肠杆菌；

（2）利用所述重组大肠杆菌进行原核表达，收集菌体；

（3）将菌体破碎，离心，收集上清；

（4）将所述上清用Ni亲和柱进行纯化，收集纯化产物；

（5）将纯化产物与胰蛋白酶共孵育，37℃反应1-4h，得到反应产物；

（6）去除所述反应产物中的胰蛋白酶；

（7）将步骤（6）所得产物进行高效液相色谱纯化，220nm处检测洗脱峰，收集22.3min处的洗脱峰；

所述高效液相色谱纯化的条件如下：

C18柱型号为Shim-pack VP-ODS，内径4.6mm，柱长250mm，填充介质为C18；

流动相由A液和B液组成；

A液：由H₂O和三氟乙酸组成，三氟乙酸在A液中的体积百分含量为0.1%；

B液：由乙腈和三氟乙酸组成，三氟乙酸在B液中的体积百分含量为0.1%；

流动相中B液的体积百分含量梯度为30%-65%，进行线性洗脱；

上样量为500ul，流动相的流速为1ml/min。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述步骤（6）中，所述去除反应产物中的胰蛋白酶的方法为：反应结束后，将所述反应物65℃加热10min，12000rpm离心5min，弃去沉淀部分,以此除去所述的胰蛋白酶。