[发明专利]一种原核基因工程杂合阳离子抗菌肽CC的获得及其发酵方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程和生物技术领域，尤其是涉及一种原核基因工程杂合阳离子抗菌肽CC的获得与发酵方法。

背景技术

抗菌肽是动、植物和人类先天性免疫机制的组成部分，在机体受到病毒、细菌等攻击时被诱导产生。抗菌肽具有广谱抗菌作用，尤其是对一些产生抗生素耐药性的病原菌的杀灭作用更引起了人们对它的兴趣。抗菌肽在农业、医疗、食品等领域的应用潜力巨大。迄今为止，已经发现了上千种天然抗菌肽，但是具有较好的医疗选择指数的种类却比较少，因此，人们希望通过分子上的重新设计，例如，杂合肽的设计等方式从丰富的天然抗菌肽资源中获得理想的新型人工抗菌肽。

杂合抗菌肽的设计特点是集两个(或以上)天然肽的优点于一身，经过适当的人工修饰后，可以扬长避短，最大程度上发挥抗菌活性，并不引起溶血。天蚕素抗菌肽(cecropins)是目前研究最清楚、效果最好的天然抗菌肽；家蝇天蚕素抗菌肽(Cec Md)是本实验室经诱导家蝇幼虫，然后克隆得到的(同源性81％)。而Chensirin是近年来发现的中国东北林蛙皮肤上分泌的天然抗菌肽，其活性很高，但具有较高的溶血活性。通过对两者进行杂合设计，获得了低溶血，高抗菌活性的新型杂合肽，与天然肽相比具有很大的优势。

人们为了得到抗菌肽主要采用了三种方法：1.直接从生物体中提取天然肽，但含量非常少，且提取工艺复杂，成本较高，难以满足大规模生产的要求；2.化学方法合成。这种方法只适用于非常短的抗菌肽，但大多数抗菌肽分子量都比较大，不适合化学和成；3.分子量比较大的抗菌肽大多都采用基因工程的方法，该方法研究的比较透彻，而且是生产抗菌肽的有效途径。如果采用基因工程学的方法生产抗菌肽，就要得到高效表达的发酵菌株，并建立其纯化和发酵的条件和方法。通过对诱导方式、诱导条件、培养基组成的优化以及建立发酵体系等进而为规模生产奠定基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供了一种原核基因工程杂合阳离子抗菌肽CC的获得及其发酵方法，得到高效表达的发酵菌株，并建立了其纯化和发酵的最优条件。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种原核基因工程杂合阳离子抗菌肽CC，其特征是，所述抗菌肽CC包括两对引物，其核苷酸序列如序列表序列3-6所示；

所述抗菌肽CC是由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的抗菌肽；

所述抗菌肽CC的核苷酸序列如序列表中序列1所示或如下序列所示；

CGCG

ATCCGCCGGG

TTGGCTGAAA

AAACTGGGCA

AGCTGAAGGC

CCATAAGGCC

ACCATCCAAA

CCACTGGCGC

CGCCCAACAA

GCCGCCAACG

TTGCCGCCAC

CCTGAAGGGT

C

GCA

其中，序列前端加入了DPP三肽序列的密码子，所述DPP三肽序列的密码子为波浪线部分；

两端各加入了BamH I和Sal I限制性内切酶位点和保护性碱基，所述BamH I和Sal I限制性内切酶位点为方框内的部分，所述保护性碱基为两尾端部分；

末端加上终止密码子，所述终止密码子为TAA，下划线部分为家蝇天蚕素抗菌肽的部分成熟肽基因序列，未划线部分为蛙防御素部分成熟肽基因序列；

所述抗菌肽CC的分子量、电荷数、等电点、疏水力矩分别为：

3487.15，+6.5，11.49，1.02。

本发明还提供了一种原核基因工程杂合阳离子抗菌肽CC的获得方法，其特征是，包括以下步骤：

S1.合成CC融合蛋白基因；

S2.构建杂合抗菌肽CC重组大肠杆菌基因工程菌；

S3.CC融合蛋白的诱导表达；

S4.CC的纯化；

S5.CC的生物学活性鉴定；

S6.CC融合蛋白诱导表达方式的转变；

S7.CC重组基因工程菌的发酵培养。