[发明专利]一种原核基因工程杂合阳离子抗菌肽CC的获得及其发酵方法

权利要求书

1.一种原核基因工程杂合阳离子抗菌肽CC，其特征是，所述抗菌肽CC包括两对引物，其核苷酸序列如序列表序列3-6所示；

所述抗菌肽CC是由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的抗菌肽；

所述抗菌肽CC的核苷酸序列如序列表中序列1所示或如下序列所示；

CGCG

ATCCGCCGGG

TTGGCTGAAA

AAACTGGGCA

AGCTGAAGGC

CCATAAGGCC

ACCATCCAAA

CCACTGGCGC

CGCCCAACAA

GCCGCCAACG

TTGCCGCCAC

CCTGAAGGGT

GCA

其中，序列前端加入了DPP三肽序列的密码子，所述DPP三肽序列的密码子为波浪线部分；

两端各加入了BamH I和Sal I限制性内切酶位点和保护性碱基，所述BamH I和Sal I限制性内切酶位点为方框内的部分，所述保护性碱基为两尾端部分；

末端加上终止密码子，所述终止密码子为TAA，下划线部分为家蝇天蚕素抗菌肽的部分成熟肽基因序列，未划线部分为蛙防御素部分成熟肽基因序列；

所述抗菌肽CC的分子量、电荷数、等电点、疏水力矩分别为：

3487.15，+6.5，11.49，1.02。

2.根据权利要求1所述的一种原核基因工程杂合阳离子抗菌肽CC的获得方法，其特征是，包括以下步骤：

S1.合成CC融合蛋白基因；

S2.构建杂合抗菌肽CC重组大肠杆菌基因工程菌；

S3.CC融合蛋白的诱导表达；

S4.CC的纯化；

S5.CC的生物学活性鉴定；

S6.CC融合蛋白诱导表达方式的转变；

S7.CC重组基因工程菌的发酵培养。

3.根据权利要求2所述的一种大肠杆菌基因工程杂合阳离子抗菌肽CC的获得方法，其特征是，所述S1过程包括：根据家蝇cecropin基因(GenBank：DQ232774)并应用生物信息学工具计算各组合的一级特征参数、预测二级和三级结构和抗菌活性，设计出具有医疗潜力的杂合抗菌肽CC，在其基因序列前端引入三肽序列(Asp-pro-pro，DPP)；根据大肠杆菌对密码子的偏爱性将杂合抗菌肽的基因序列翻译成核酸序列，在其两端加上BamH I和Sal I限制性内切酶位点和保护性碱基，末端加上终止密码子，合成两对引物F1、R1，F2、R2，应用重叠PCR技术合成杂合抗菌肽CC的基因；所述两对引物的核苷酸序列如序列表中序列3-6所示。

4.如权利要求2所述的一种大肠杆菌基因工程杂合阳离子抗菌肽CC的获得方法，其特征是，所述S2过程包括：构建CC克隆质粒pMD18-T／CC并测序鉴定，构建表达质粒pGEX-6p-1／CC并测序鉴定，构建基因工程菌株pGEX-6P-1／CC／BL21(DE3)并测序鉴定，所述测序鉴定为：测序结果使用NCBI Blast与所设计的基因进行对比，选取两者结果一致的重组菌为测序结果正确的重组菌。

5.如权利要求2所述的一种大肠杆菌基因工程杂合阳离子抗菌肽CC的获得方法，其特征是，所述S3过程中包括：将步骤S2中测序结果正确的重组菌和含有空载体的对照菌进行平板培养、种子培养，将发酵液中菌体生长到对数期后分别加入IPTG诱导表达，然后进行SDS-PAGE分析和western blot分析，选取表达成功的杂合抗菌肽CC。

6.如权利要求2所述的一种大肠杆菌基因工程杂合阳离子抗菌肽CC的获得方法，其特征是，所述S4过程包括：将基因工程菌pGEX-6P-1／CC／BL21(DE3)大量培养、诱导，收集菌体并获得融合蛋白包涵体，经变性、复性后进行亲和层析纯化，纯化后的融合蛋白经甲酸切割后去除标签，然后进行定量，纯化样品保留。