[发明专利]基于组织因子的肿瘤多肽疫苗、制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种多肽疫苗、制备方法及其应用，尤其是一种肿瘤多肽疫苗、制备方法及其应用。

背景技术

组织因子(tissue factor, TF) 的凝血功能众所周知，它与活化凝血因子Ⅶ(activated factor Ⅶ, F Ⅶa) 结合后，形成TFPF Ⅶa复合物，启动外源性凝血途径；亦可激活凝血因子Ⅺ，启动内源性凝血系统。它是机体内活性最强的促凝物质之一，在生理性止、凝血过程及多种血栓栓塞性疾病中发挥重要作用。然而，TF作为凝血系统中惟一在细胞表面表达的跨膜糖蛋白，是否具有受体特性并具备非凝血功能，逐渐成为众多学者关注的焦点。近期研究提示，TF具有信号传导受体的功能，可通过介导多种信号传导，影响肿瘤侵袭与转移、胚胎发育、血管新生、炎症、动脉粥样斑块形成等多种病理、生理过程。

以组织因子作为靶点来治疗肿瘤是现在肿瘤研究中的一个热点。最直接的优点就是靶向性好。正常的生理条件下，TF一般不外露，只有在肿瘤血管内皮和肿瘤细胞中才特异性表达升高。这就为肿瘤的靶向免疫治疗提供了可能。但是如果用TF全蛋白免疫，就很可能带来全身性的凝血功能障碍。

国外学者以组织因子为靶点，进行免疫治疗，最有成就的进展是HU和Garen将免疫球蛋白G1（IgG1）的Fab段换作凝血因子VII（FVII），即TF的天然配基，同时突变FVII的341密码子：从赖氨酸AAG突变为丙氨酸GCC，使二者结合以后的促凝活性部分丧失。结果发现具有良好的抗肿瘤作用。但是，他们以TF全蛋白作为靶点，用抗体或FVII进行治疗，存在着蛋白质结构复杂、工艺难度大、易引发机体过敏反应等缺点。

发明内容

本发明的目的是提供一种以组织因子为靶抗原表位的肿瘤多肽疫苗。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：一种基于组织因子的肿瘤多肽疫苗，其活性成分为将人源TF基因中的包含表位靶点的DNA序列片段表达后形成的门冬酰胺酶（AnsB）-TF表位靶点融合蛋白，其中包含的TF表位靶点多肽片段为位于TF蛋白表面的易引起免疫反应的多肽片段。 

进一步的，所述TF表位靶点多肽片段的序列为：GDWKSKCFYTTDTECDLTDE（SEQ ID NO：1）。

进一步的，所述疫苗在AnsB的C端加入一个25肽的破伤风毒素T细胞辅助表位TTP作为支臂，在TTP之后又加了一个3肽的柔性接头Ser-Gly-Thr，TF表位靶点多肽片段接于柔性接头后，形成AnsB-TTP -TF的结构，其序列见SEQ ID NO：2。

本发明还提供了上述的基于组织因子的肿瘤多肽疫苗的制备方法，其步骤包括：将人源包含TF表位靶点的DNA序列片段插入AnsB下游，获得相应的重组基因工程菌；重组基因工程菌经发酵后在大肠杆菌中表达出AnsB-TF表位靶点融合蛋白，经纯化后得到基于组织因子的肿瘤多肽疫苗。

进一步的，其步骤包括：

（1）用加端PCR的方法在AnsB-TTP序列后加入人源TF基因中的包含表位靶点的DNA序列，获得AnsB-TTP-TF序列；

（2）构建重组质粒pET28-ansB-TTP-TF；

（3）将重组质粒pET28-ansB-TTP-TF转化到感受态的大肠杆菌中，经筛选后的阳性菌活化培养；

（4）裂解菌体后分离提纯，得到AnsB-TF表位靶点融合蛋白。

本发明还提供了上述的基于组织因子的肿瘤多肽疫苗在制备预防和治疗黑色素瘤药物中的应用。

本发明还提供了上述的基于组织因子的肿瘤多肽疫苗在制备预防和治疗乳腺癌、前列腺癌、胃癌、胰腺癌或肺癌药物中的应用。

通常，多肽疫苗免疫原性较弱，本发明通过基因工程手段将包含表位靶点的TF多肽片段与AnsB载体相连，获得了一种以组织因子为靶抗原表位的肿瘤多肽疫苗。该疫苗通过对TF表位靶点的主动免疫获得对肿瘤的预防和治疗作用。这种主动免疫不但能完全阻断TF在肿瘤表面的效应，还避免了多次给药的麻烦。

为获得有酶活性的融合蛋白，本发明将TF表位靶点多肽片段融合于AnsB的C端而非N端。为增强TF表位的免疫原性，在AnsB和TF之间加入了一个25肽的破伤风毒素T细胞辅助表位TTP作为支臂。为保持连接于TTP之后的TF在结构上的柔韧性， 在TTP之后又加了一个3肽的柔性接头Ser-Gly-Thr，TF接于其后。这些优化设计有利于AnsB-TF融合蛋白在大肠杆菌的周质中形成可溶性表达且具有催化活性的嵌合酶分子。

附图说明