[发明专利]一种甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种检测的试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒的试剂包括检测引物、10×PCR Easy Taq缓冲液2.0μl、10mM 的dNTPs0.5μl、活性酶浓度为5U/ml的 Taq聚合酶0.4μl、甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种阳性对照DNA各1μl、重量浓度≥99%的超纯水20ul；检测引物包括浓度为1pmol/μl的枯萎病菌通用引物W106R、W106S各1μl，浓度均为10pmol/μl 的甘蓝枯萎病菌1号生理小种的上游引物1#77R、下游引物1#77S各1μl，浓度均为10pmol/μl 的甘蓝枯萎病菌2号生理小种上游引物2#40R、下游引物2#40S各1μl；1#77R的序列5'- AAATCCAAGGTGCGAAGA -3'，1#77S的序列为5'- CCAGGCTACACTAATACAACAG -3'，2#40R的序列为5'- CTTTCGCTTCTCCCTTCA -3'，2#40S的序列为5'- AACGCATCGTCTTCTATT -3'。

2.一种采用权利要求1所述试剂盒检测甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤，(1)利用NuClean Plant Gen DNA Kit试剂盒提取被甘蓝枯萎病菌1号或2号生理小种感染的植物组织DNA，利用PowerSoil DNA Isolation Kit 试剂盒方法提取被甘蓝枯萎病菌侵染的土壤DNA；

（2）采用检测试剂盒对（1）步分离出的DNA进行PCR扩增；

（3）将6μl步骤（2）的PCR扩增产物用质量浓度为1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，分离后再经溴化乙锭染色于紫外灯下根据扩增产物的大小判定结果，当同时扩增出两条大小分别为729bp和1927bp产物时，可判断植物组织或土壤中存在甘蓝枯萎病菌1号生理小种，当同时扩增出两条大小分别为729bp和309bp产物时，可判断植物组织或土壤中存在甘蓝枯萎病菌2号生理小种。

3.根据权利要求2所述检测甘蓝枯萎病菌的方法，其特征在于，所述步骤（2）的具体操作方法是，①取（1）步的DNA1μl，将其与试剂盒的试剂混合，该试剂盒的试剂包括浓度为1pmol/μl的枯萎病菌通用引物W106R、W106S各1μl，浓度为10pmol/μl 的甘蓝枯萎病菌1号生理小种上游引物1#77R、下游引物1#77S各1μl，浓度为10pmol/μl 的甘蓝枯萎病菌2号生理小种上游引物2#40R、下游引物2#40S各1μl ，10×PCR Easy Taq缓冲液2.0μl、10mM 的dNTPs0.5μl、活性酶浓度为5U/ml的 Taq聚合酶0.4μl、甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种阳性对照DNA各1μl、重量浓度≥99%的超纯水20ul； 

②将①步的混合物放入PCR仪器中进行扩增，PCR扩增程序为：94 °C 预变性 5 min；94°C变性 40 sec；60°C退火 30 sec；72 °C延伸 1 min 30sec； 35 个循环，最后 72 °C延伸10 min。