[发明专利]一种甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种检测的试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于农作物病害检测鉴定及植物检疫的领域，具体是一种甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种的检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

现在公知的甘蓝枯萎病菌就是尖孢镰刀菌粘团专化型，尖孢镰刀菌粘团专化型（Fusarium oxysporum f. sp. Conglutinans）引起的甘蓝枯萎病是一种毁灭性的土传病害，在全球大部分甘蓝产区均有发生，该病自2001年在我国首次报道发生以来，先后在河北省张家口市、山西省晋中市和山西省大同市均有发生，在我国的发生呈蔓延趋势，并逐年加重，已成为影响我国甘蓝品质和产量的重要病害。根据危害寄主甘蓝的品种，可分为2个生理小种，目前我国甘蓝生产主要受到1号生理小种的危害。该病自2001年在我国延庆地区发现以来，发病面积逐年增加，已成为威胁我国甘蓝生产的重要因素。目前生产上缺少有效防控甘蓝枯萎病的方法，因此，快速稳定的病原菌鉴定与检测体系是对该病害进行综合防控的基础。现有甘蓝枯萎病菌生理小种的鉴定与检测技术仍然以传统形态学鉴定和鉴别寄主鉴定为主。但是形态学鉴定需要经验极其丰富的专家操作并且生理小种之间形态学差异较小，难以得到准确的鉴定结果。而利用鉴别寄主鉴定生理小种费时费力且需要大量的品种。随着生命科学的高速发展，包括AFLP，RFLP，以及SCAR在内的分子检测技术在病原菌的应用得到植物病理学家的重视，基于各生理小种的特异基因设计特异性引物已经广泛应用于枯萎病菌生理小种的分子检测。

植物病理学家已基于特异性引物成功建立了快速检测番茄枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. ciceris），香蕉枯萎病菌（F. oxysporum f. sp. cubense），莴苣枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.lactucae），香石竹枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. dianthi），豌豆枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.pisi）和唐菖蒲枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. gladioli）不同生理小种的分子鉴定体系。利用这一技术在对香蕉枯萎病进行分子诊断时的灵敏度达到0.2μg 新鲜菌丝的水平。同时该技术也在种子，土壤以及发病组织中病原菌的检测上得到了充分应用。三重PCR检测技术也在香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种鉴定中得到了应用。甘蓝枯萎病菌生理小种的检测与鉴定技术尚未见报道，本研究在甘蓝枯萎病菌1，2号生理小种全基因组测序数据基础上，筛选出两小种各自的特异引物并引入尖孢镰刀菌通用引物W106R/W106S为内标，建立起一步三重PCR快速检测甘蓝枯萎病菌1，2号生理小种的技术。

发明内容

为解决上述检测甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种技术存在的缺陷，本发明公开了一种甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种检测试剂盒及其检测方法，其目的是针对现有技术中甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种的生物学检测方法所需周期长，且目前尚未有甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种分子检测方法的问题，通过对甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种进行全基因组测序，并通过比较基因组学的方法找出甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种的特异基因组片段，然后这针对甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种的特异片段碱基序列分别设计特异引物，用于带甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种的植物组织和土壤的高灵敏度快速分子检测，并提供一种准确性高、操作简便、特异性强且灵敏度高的甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种快速分子检测的试剂盒，该试剂盒可用于带菌的植物组织和土壤的高灵敏度快速分子检测，对于甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种引起病害显症之前的早期检测和诊断具有十分重要的意义。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为，本发明公开了一种甘蓝枯萎病菌的检测试剂盒，该试剂盒包括，浓度为1pmol/μl的枯萎病菌通用引物W106R、W106S各1μl，浓度为10pmol/μl 的甘蓝枯萎病菌1号生理小种特异引物1#77R、1#77S各1μl，浓度为10pmol/μl 的甘蓝枯萎病菌2号生理小种特异引物2#40R、2#40S各1μl ，10×PCR Easy Taq缓冲液2.0μl、10mM 的dNTPs0.5μl、活性酶浓度为5U/ml的 Taq聚合酶0.4μl、甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种阳性对照DNA各1μl、重量浓度≥99%的超纯水20ul。检测引物的序列：

W106R的序列5'- GCAGTCGTACGTCATCGACC -3'、