[发明专利]一种凝胶层析柱的装柱方法及其检测

说明书

技术领域

本发明属于色谱技术领域，具体涉及一种层析交换柱的制备方法及其检测。

背景技术

凝胶层析又称凝胶过滤，是一种按分子量大小分离物质的层析方法。该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。大分子不能进入凝胶颗粒中的静止相中，只留在凝胶颗粒之间的流动相中，因此以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。

凝胶层析法是水溶性物质的一种快速而简单的分离分级方法，广泛应用于生物化学、分子生物学和医学等相关领域，是分离提纯蛋白质、生物酶、核酸和多糖类等生物大分子物质不可缺少的技术手段，也可用于样品的浓缩和脱盐及测定生物大分子的分子质量等方面。

传统的装柱工艺中使用纯化水配制凝胶悬浮液，然后将凝胶悬浮液缓缓加入柱中，完成装柱。该方法中因选用纯化水进行匀胶，不能使凝胶颗粒很好的分散，造成凝胶颗粒自然沉降速度过快和凝胶床不均匀，从而使得凝胶柱床层出现裂纹，影响层析效果。同时还需要经常重装柱子，增大了工作强度，使工作效率降低。因此迫切需要一种快速、高质量的装柱方法、以节约时间、提高效率。

柱效检测是装柱完成后对系统进行检测，测柱效方法使用丙酮作为示踪剂进行柱效检测，但丙酮为有毒试剂，且易挥发，对实验操作人员具有一定的影响；同时，丙酮容易残留在柱子中，在后续的工艺中很难将其完全去除，对产品的质量和安全性具有一定的影响。因此需要一种安全有效的柱效检测体系，以提高产品的质量和安全性，同时避免影响实验人员健康。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提出一种凝胶层析柱的装柱方法，用碱和盐配制凝胶悬液及装柱缓冲液，用磷酸缓冲液平衡层析柱的方法进行装柱；柱效检测为用氯化钠（NaCl）代替丙酮进行柱效检测的一种方法。

本发明的另一目的是提出一种凝胶层析柱的检测方法。

实现本发明上述目的的技术方案为：

1、一种凝胶层析柱的装柱方法，包括步骤：

1）配制凝胶悬液：在凝胶中加入碱盐缓冲液，所述碱盐缓冲液为体积比例为1:1.0-3.0混合的0.02-0.4mol/L NaOH溶液和含有0.05-0.8mol/L NaCl的PBS磷酸盐缓冲溶液，制成凝胶和碱盐缓冲液混合的凝胶悬液；

2）装柱：

a)在柱管底部加入纯化水，然后将凝胶悬液倒入柱管，纯化水体积为凝胶悬液体积的1-10%；

b)装上层析柱的柱头，使凝胶悬液置于柱头活塞下；

c)泵入0.02-0.4mol/LNaOH溶液与含0.05-0.8mol/L NaCl的PBS磷酸盐缓冲溶液1:1.0-3.0混合的碱盐缓冲液，待凝胶悬液液面高度不变时，开始下一平衡步骤；

3）平衡：用含0.05-0.8mol/LNaCl的磷酸盐缓冲液平衡1-3倍柱体积，平衡流速为30±5cm/h（缓冲液体积为柱体积1-3倍）；

4）柱效检测：用1-4mol/L NaCl作为示踪剂，监测电导值变化，得到柱效结果。

凝胶为惰性载体，例如各种型号的葡聚糖凝胶，包括Sephacryl High Resolution系列的凝胶等。

其中，所述步骤1）中，凝胶和碱盐液的比例1:1.0-3.0。

其中，所述步骤2）中，泵入所述碱盐混合液时恒定压力（泵的压力）为1±0.1bar。

具体地，所述步骤4）为：用1-4mol/LNaCl作为示踪剂，上样体积为柱体积的1-4%，用含0.05-0.8mol/LNaCl的磷酸盐缓冲液洗脱，上样流速与洗脱流速均为30±5cm/h，洗脱1-3倍柱体积（洗脱的缓冲液体积为1-3倍柱体积），监测电导值变化，得到柱效结果。

其中，所述磷酸盐缓冲溶液的pH值为7.0-7.5。磷酸盐缓冲溶液用常规方法配制，通常为0.01-0.2mol/L的磷酸二氢钾和磷酸氢二钠配制而成，优选0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液。

优选地，所述NaOH溶液和磷酸盐缓冲溶液体积比例为1:3。

一种凝胶层析柱柱效的检测方法，其是用1-4mol/L NaCl作为示踪剂，监测电导值变化，得到柱效结果。