[发明专利]一种淡水小龙虾MT基因表达模式用于水体质量评价的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种淡水小龙虾MT基因表达模式用于水体质量评价的方法，属于环境生物技术领域。

背景技术

随着我国经济快速发展的同时，从中央到地方的各级政府十分重视环境保护的问题。在解决经济需要快速发展与环境保护问题日趋严重的矛盾的过程中，各级政府都制定了十分严格的规章制度和处理措施，尤其是将水体环境保护工作作为了首要任务。从历年来频繁出现的水体受污染之后引起的重大环境与居民身体健康问题来看，水环境的保护工作刻不容缓。以频繁出现的企业恶意排污造成的水体污染与当地居民癌症发生率激增的问题来看，各级环境保护部门对于所辖企业在生产过程中产生的污水的监管与检测，需要更为严格、科学、全面的检测手段，对于污水的处理需要更为科学的技术。

目前，在检测相关企业在生产过程中产生的污水是否达到相关排放标准，各级环保部门通常采用的检测方法是化学检测法。化学检测方法主要是通过以标准物质作为参照，通过仪器的测定来确定被检测水样中的污染物的种类与浓度。通过多次反复测定，化学检测法可以确定出被检测水样中存在的污染物的种类与浓度，与相关排放标准比较之后，可以确定是否达到排放要求。但是，在这个检测过程中，存在一个较大的化学与生物学问题，如果一个被检测的水样通过化学检测法的结果来看，发现样品中存在的多个污染物的含量并没有超过国家标准，说明已经达到了排放的要求。但是，从生物学的效应累加角度来看，水体中所有没有超标的污染物对于生物体的影响作用累加起来，就有可能会造成较为严重的后果，尤其是对于人的身体健康的影响。

淡水小龙虾学名为克氏原螯虾，在我国南方和北方都有养殖，它是一个非常常见的甲壳类动物的模式生物，对于生物学试验的研究结果具有一定的指示作用，因为淡水小龙虾便于获得，易于饲养，同时又具有代表意义，所以非常适合作为水体环境质量的指示生物。淡水小龙虾MT基因的全称是金属硫蛋白基因，它在小龙虾受到外界环境胁迫刺激的过程中，会通过调整自身的基因表达量来实现对抗环境胁迫的作用，来进行自身保护，它是一个非常好的能够反映外界环境胁迫程度的指示基因。而淡水小龙虾18S rRNA基因是动物体中的一个持家基因，不论在什么条件的胁迫刺激作用下，18S rRNA基因的表达量不会受到影响。因此，通过将淡水小龙虾MT基因的表达情况与18S rRNA基因进行比较，就可以获得环境胁迫刺激作用下的淡水小龙虾MT基因的相对表达量，来进一步反映环境的污染情况。

长期以来，对于水体是否受到污染，环境保护部门多采用化学检测的方法，这种方法存在检测手段单一，不能全面说明受污染水体存在的潜在生物学安全问题，而且，这种方法不能够从生物学角度来合理说明水体污染的生态毒理效应。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速、全面检测水体质量的一种淡水小龙虾MT基因表达模式用于水体质量评价的方法，该方法利用基因表达模式来定性评价水体污染产生的生态毒理效应。

技术解决方案：

本发明采用MT基因的表达模式进行水体质量评价。

本发明的具体方法如下：

1）污水水样的预处理：对污水原水进行稀释，稀释倍数为原水的5倍-10倍；

2）污水胁迫刺激：将步骤（1）中稀释后的污水分成三组，将小龙虾分别放入，同时进行平行试验，小龙虾的放入数量以保证每个取样时候时间点都有活的小龙虾；

3）模板制作：采用总RNA提取联合cDNA反转录合成的方法制作cDNA样品；

4）实时荧光定量PCR技术确定MT基因的表达模式：以步骤（3）制备的cDNA样品作为模板进行实时荧光定量PCR，过程中使用的淡水小龙虾MT基因扩增引物为MT-qRT-F引物：5`-gagtgtgccgagggcgggt-3`，MT-qRT-R引物：5`-gcagggcttggagcaggtc-3`，扩增作为内参的淡水小龙虾18S rRNA基因的引物是18S-qRT-F引物：5`-tcttcttagagggattagcgg-3`，18S-qRT-R引物：5`-aaggggattgaacgggtta-3`，具体扩增程序的反应条件为：95℃预变性3min，之后为反复进行的40个循环，每个循环设置为：95℃变性30s，59℃退火30s，从55℃-95℃按照每秒升高0.5℃的进度进行退火，获得反应过程对应的溶解曲线，并且进行Ct值读数；