[发明专利]一种淡水小龙虾MT基因表达模式用于水体质量评价的方法

权利要求书

1.一种淡水小龙虾MT基因表达模式用于水体质量评价的方法，其特征在于，采用MT基因表达模式进行水体质量评价。

2.根据权利要求1所述的一种淡水小龙虾MT基因表达模式用于水体质量评价的方法，其特征在于，包含以下步骤：

1）污水水样的预处理：对污水水样进行稀释，稀释倍数为污水水样的5倍-10倍；

2）污水胁迫刺激：将步骤（1）中稀释后的污水分成三组，将小龙虾分别放入进行胁迫刺激，同时进行平行试验，小龙虾的放入数量要保证每个取样时间点都有活的小龙虾可取；

3）模板制制备：采用总RNA提取与cDNA的反转录合成联合的方法来制备cDNA；

4）实时荧光定量PCR技术确定MT基因的表达模式：以步骤（3）制备的cDNA作为模板进行实时荧光定量PCR，过程中使用的淡水小龙虾MT基因扩增引物为MT-qRT-F引物：5`-gagtgtgccgagggcgggt-3`，MT-qRT-R引物：5`-gcagggcttggagcaggtc-3`，扩增作为内参的淡水小龙虾18S rRNA基因的引物是18S-qRT-F引物：5`-tcttcttagagggattagcgg-3`，18S-qRT-R引物：5`-aaggggattgaacgggtta-3`，具体扩增程序的反应条件为：95℃预变性3min，之后为反复进行的40个循环，每个循环设置为：95℃变性30s，59℃退火30s，从55℃-95℃按照每秒升高0.5℃的进度进行退火，获得反应过程对应的溶解曲线，并且进行Ct值读数；

5）定性评价淡水小龙虾MT基因的表达模式与水样污染程度之间的关系：对步骤（4）溶解曲线读取的Ct值数据进行分析，数据分析的具体方法为：数据的计算形式为2^-ΔCt，其中每一个时间点的ΔCt=（MT基因平均Ct值-18S rRNA基因平均Ct值），之后利用excell数据分析工具，以胁迫时间作为横坐标，以2^-ΔCt值作为纵坐标来绘制柱形图，最后要以正常组淡水小龙虾的2^-ΔCt值作为参照，采用T检验的数据分析方法分析其他各个取样时间点的2^-ΔCt数值与正常组淡水小龙虾的2^-ΔCt数值之间的显著性差异，当淡水小龙虾MT基因的最高相对表达量对应的2^-ΔCt数值与正常组淡水小龙虾的2^-ΔCt数值之间存在显著性差异的时候，确定为中度污染，当淡水小龙虾MT基因的最高相对表达量对应的2^-ΔCt数值与正常组淡水小龙虾的2^-ΔCt数值之间存在极显著差异的时候，确定为严重污染。