[发明专利]一种食品中沙门氏菌活菌的快速检测试剂盒及使用方法

说明书

技术领域

本发明属于食品检测领域，具体涉及一种食品中沙门氏菌活菌的快速检测试剂盒，还涉及一种食品中沙门氏菌活菌的快速检测试剂盒的使用方法，该试剂盒适用于各类食品和食物中毒样品中沙门氏菌的检测。本发明适用于食品生产企业、食品加工企业、超市、农贸市场、水产品批发市场的快速检测及国家相关职能检测机构实验室检测。

背景技术

沙门氏菌(Salmonella sp.)，革兰氏阴性杆菌，目前已发现2600多种血清型，我国已有200多种，具有内毒素和侵袭能力。由沙门氏菌引起的疾病为常见的人畜共患病人体食入一定数量的活菌会导致食物中毒。在我国细菌性食物中毒中，有70%-80%是由沙门氏菌引起的，而在引起沙门氏菌中毒的食品中，约90%是肉、蛋、奶等畜产品。2012年8月美国曾爆发因食用了被污染鸡蛋而感染沙门氏菌的食品安全事件。

目前我国国标对于沙门氏菌的检测仍采用传统的先增菌再选择培养最后进行生化鉴定的定性方式。该方法的不足之处在于耗时长、步骤繁琐和无法定量检测。传统方法检测全过程一般需要至少5-7d，才能得到明确的诊断结果。这大大降低了检测效率，严重影响了对沙门氏菌监测的时效性。因此社会对于快速准确沙门氏菌检测方法的需求仍十分迫切。

近年来，有大量研究是基于PCR检测方法，PCR检测方法在操作时间，检测的特异性和灵敏度方面较常规方法均有较大提高，但PCR检测方法需要精密的PCR仪，它的检测时间也较长(2～4h)，并且反应过程很容易受污染物的影响，从而使得这种方法不能满足实地快速检测的需求。另外还有一些检测方法，比如免疫色谱法、DNA杂交法，虽然检测灵敏度高，但是所需设备和操作过程比较复杂，也不能满足实地快速检测的需求。

环介导等温扩增法(LAMP)是2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计2对特异性引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件(60～65℃)保温30～60min，即可完成核酸扩增反应。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。LAMP是一种全新的核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。

现有技术中已经有沙门氏菌检测试剂盒和检测方法，但在实际使用过程中存在着无法区分沙门氏菌活体菌与死菌，对检测结果影响很大。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种食品中沙门氏菌（Salmonella）活菌的检测试剂盒，能快速检测食品中沙门氏菌活菌，与PCR检测方法相比较，PMA-LAMP检测方法提高了检测特异性、灵敏度和准确性。与传统LAMP检测方法相比较，PMA-LAMP检测方法可以区分试样中的活菌和死菌，只检测试样中存在的沙门氏菌活菌，结果更准确，极大的降低了假阳性结果产生。同时传统LAMP检测方法其特点是针对靶基因的6个区域设计2对特异性引物，而本发明对传统LAMP检测方法进行了创新，其特点是针对靶基因的6个区域设计3对特异性引物，使得检测特异性、灵敏度和准确性有较大的提高。

本发明的另一个目的是在于提供了一种食品中沙门氏菌活菌的检测试剂盒的使用方法，方法易行，操作简便。通过该方法，可快速、灵敏的检测食品中沙门氏菌活体菌，该方法在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种沙门氏菌LAMP检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括以下成分：10×反应缓冲液；Bst DNA聚合酶；dNTPs；MgSO₄；引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP、引物Loop-F、引物Loop-R；1000×SYBR Green I荧光染料；阳性对照。

10×反应缓冲液配方：200mM Tris-HCl、100mM KCl、10mM(NH₄)₂SO₄、1.0%(质量

体积比)Tritonx-100。

引物F3：5'CGGCCCGATTTTCTCTGC3'

引物B3：5'CGGCAATAGCGTCACCTT3'

引物FIP：5'GCGCGGCATCCGCATCAATATGCCCGGTAAACAGATGAGT3'