[发明专利]驼乳中重链抗体的分离纯化及鉴定

说明书

技术领域

本发明提供了一种从双峰驼乳中筛选纯化重链抗体的方法，及对纯化得到的抗体进行鉴定的方法，所述方法还测定了重链抗体在乳清IgG所占的含量比例。本发明属于生物化学领域，更具体地涉及抗体的分离纯化技术领域。

背景技术

免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)是指具有抗体活性，能与相应的抗原发生特异性结合的球蛋白，在机体内主要以分泌型和膜型两种形式存在，前者主要在血液（血清）、组织液及其他外分泌液中发挥各种免疫功能，后者存在于B细胞表面。抗体因结构不同可分为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE5种，多数为丙种球蛋白。Ig分子的基本结构是由四肽链组成的，即由二条相同的分子量较小的轻链（L链）和二条相同的分子量较大的重链（H链）组成的。由二硫键连接L链与H链形成的一个四肽链分子是构成免疫球蛋白分子的基本结构的Ig分子单体。Ig的主要生物学特性是与相应的抗原发生特异性结合、激活补体和促进吞噬作用等。

免疫球蛋白是骆驼常乳和初乳中最值得关注的免疫因子。骆驼常乳和初乳中主要的免疫球蛋白是IgG，而IgM、IgA含量很少。与牛IgG不同的是骆驼IgG有三个亚类，分别为IgG₁、IgG₂、IgG₃。早在1993年，比利时的Hamers-Casterman等、Muyldermans等偶然发现在骆驼血清中存在两种结构的天然IgG抗体，一种为具有两条重链和两条轻链的常规四聚体抗体IgG₁（约170kD），另一种为仅由两条重链构成的二聚体抗体，被称为重链抗体（heavychain antibodies，HCAb），包含IgG₂（约100kD）和IgG₃（约90kD）亚型，与一般抗体相比,这些重链并不与轻链缔合，它们的重链可变区(VHH)与铰链区之间并没有传统免疫球蛋白中的第一稳定区（CH1），可变区直接与铰链区和Fc相连接，重链抗体的VHH还具有不同于VH的特征。但是这种二聚体免疫球蛋白仍能像正常抗体一样与抗原等靶标紧紧结合，而且不像单链抗体那样互相黏连聚集成块，它在骆驼的体液免疫中发挥着重要的作用。研究发现，除骆驼科外，人类中的一些重链病患者含有缺失轻链、无法确切界定VH与CH1的抗体，一些软骨鱼如护士鲨和斑纹须鲨体内也发现类似骆驼重链抗体结构的新抗原受体（new antigen receptor，NAR），它也仅由重链构成。

免疫球蛋白分离纯化的方法有很多，目前亲和层析技术被广泛的应用在蛋白质研究和制备领域，是分离纯化以及分析生物大分子尤其是蛋白质的有力工具。只需要一步处理即可使某种待分离的蛋白质从复杂的蛋白质混合物中分离出来，达到千倍以上的纯化，并保持较高的活性。Protein A和protein G对抗体的亲和力不同，能特异性地与免疫球蛋白的Fc区结合，所以亲和介质可用于抗体（单克隆抗体和多克隆抗体）的分离纯化，经过一步亲和层析，即可得到高纯度的抗体。

世界上许多国家将驼乳视为上等的营养性食品。在干旱地区居民的饮食结构中，缺少绿色蔬菜和水果，而驼乳中高含量的VC、Niacin(PP烟酸)具有重要的营养价值，它为处于干旱和半干旱地区农牧民提供优质的蛋白，也是非常重要的营养来源之一。除了供羔驼哺食外，挤乳量不高。但驼的泌乳期长（15个月以上），乳汁浓厚，气味正常，乳中干物质多，乳脂率高，乳蛋白中氨基酸含量完全，驼奶脂肪球小，易于消化吸收，适于婴幼儿及老人和病人饮用。