[发明专利]驼乳中重链抗体的分离纯化及鉴定

权利要求书

1.一种从双峰驼乳中筛选纯化重链抗体的方法，其特征在于该方法步骤包括：

（1）用0.02M pH7.4的PBS结合缓冲液平衡protein A/G柱子，至仪器的各条基线都平后，将过滤后的乳清以PBS结合缓冲液5倍稀释，上样至Protein G层析柱，结合10min，收集流穿液；

（2）用20倍柱床体积的0.02M的pH7.4的PBS结合缓冲液洗涤层析柱后，分别以洗脱缓冲液B和洗脱缓冲液C先后洗脱IgG₁及IgG₃，洗脱后立即用中和缓冲液调节洗脱液pH值至7.4，并以结合缓冲液将层析柱洗涤至中性，洗脱流速2mL/min，其中洗脱缓冲液B为含0.58%乙酸的pH3.5的0.15mol·L^-1NaCl，洗脱缓冲液C为pH2.7的0.1mol·L^-1甘氨酸，中和缓冲液为pH9.0的1mol·L^-1Tris-HCL；

（3）将收集的Protein G层析柱流穿液，上样至Protein A层析柱，10倍柱体积结合缓冲液洗涤层析柱去除杂蛋白，以洗脱缓冲液D洗脱IgG₂亚型重链抗体，立即中和洗脱液至pH值达7.4，并以结合缓冲液将层析柱洗涤至中性，洗脱流速1.5mL/min，洗脱缓冲液D为pH2.0的0.1mol·L^-1甘氨酸；

（4）用截留分子量为30kDa的超滤离心管，浓缩蛋白并除盐，超滤浓缩40-50倍；制备得到纯化的IgG₁、IgG₂和IgG₃，其中纯化后的IgG₁为常规四聚体抗体，IgG₂和IgG₃亚型为二聚体抗体，即为重链抗体。

2.根据权利要求1所述的一种从双峰驼乳中筛选纯化重链抗体的方法，其特征在于,在步骤(1)中进行上样时，上样至10mL Protein G aogarose FF层析柱，需连续上柱2次，以保证抗乳清与填料的结合。

3.根据权利要求1所述的一种从双峰驼乳中筛选纯化重链抗体的方法，其特征在于，在步骤(3)中进行上样时，将收集的Protein G aogarose FF层析柱流出液以每分钟1.5mL的速度上样至10mL Protein A aogarose FF层析柱。

4.根据权利要求1所述的一种从双峰驼乳中筛选纯化重链抗体的方法，其特征在于其中的乳清是通过如下步骤制备得到的：采用低温高速离心的方法分离乳清，然后再用0.22μm的针头滤器过滤分离后的乳清。

5.根据权利要求4所述的一种从双峰驼乳中筛选纯化重链抗体的方法，其特征在于其中低温高速离心的方法为低温15000×g离心60min。

6.根据权利要求1所述的一种从双峰驼乳中筛选纯化重链抗体的方法，其特征在于，该方法还包括对浓缩后的三个亚类IgG的纯度和含量进行检测。

7.根据权利要求6所述的一种从双峰驼乳中筛选纯化重链抗体的方法，其特征在于，其中检测三个亚类IgG纯度的方法为SDS-PAGE电泳和蛋白质印迹法。

8.根据权利要求6所述的一种从双峰驼乳中筛选纯化重链抗体的方法，其特征在于，其中测量三个亚类IgG含量的方法为ELISA法。