[发明专利]骨碱性磷酸酶检测试纸及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白质、肽或氨基酸的检测领域，具体是骨碱性磷酸酶检测试纸及其制备方法。 

背景技术

骨碱性磷酸酶(NBAP)是成骨细胞的表型标志物之一，它可直接反映成骨细胞的活性或功能状况,主要用于小儿佝偻病早期诊断和亚临床鉴别的特异性参考指标,也是目前用于评价人体骨矿化障碍的最佳指标。 

骨源性碱性磷酸酶是由骨质中分泌出来，当骨头中钙盐沉淀不足时，该酶分泌增多，骨中钙盐充足时就分泌减少，所以用来帮助检查有无钙吸收不足。检测小儿血中骨源性碱性磷酸酶催化活性，籍以筛查或辅助诊断因钙营养不良引起的骨钙化障碍或其他原因引起的代谢性骨病。 

骨碱性磷酸酶正常参考值如下：正常水平≤200u/L；预防水平250u/L；医疗水平300u/L。 

目前，血清中骨碱性磷酸酶含量的主要检测方法包括电泳法、凝集素酶促化学法、酶联免疫法等。但是，上述这些检测方法要么需要依赖相应的复杂的仪器设备，要么所需样本为血清而且用量较大，而且还需要使用液体试剂，因此，存在检测程序复杂、检测速度慢以及检测结果不可靠、也不适用于婴幼儿这一骨碱性磷酸酶异常高发人群的缺陷。 

发明内容

针对现有技术存在的检测程序复杂、检测所需标本量等缺陷，本发明提供一种骨碱性磷酸酶定量检测试纸及其制备方法。 

本发明的技术方案如下： 

一种骨碱性磷酸酶检测试纸，包括反应底板，粘贴于反应底板中部的硝酸纤维素膜、分别搭接于硝酸纤维素膜两侧的胶体金垫、吸水滤纸和与胶体金垫搭接的样品垫，所述硝酸纤维素膜上按顺序依次平行设置有骨碱性磷酸酶多克隆抗体构成的检测条带和羊抗鼠IgG多克隆抗体构成的质控条带，所述胶体金垫由含有胶体金标记的骨碱性磷酸酶单克隆抗体涂覆于无纺布上而构成的。

所述样品垫的一端重叠设置在胶体金垫一端的上方，胶体金垫的另一端重叠设置在硝酸纤维素膜一端的上方，且位于骨碱性磷酸酶多克隆抗体检测条带一端，所述硝酸纤维素膜靠近羊抗鼠 IgG 多克隆抗体质控条带的一端重叠设置在吸水滤纸一端的下方。 

所述骨碱性磷酸酶多克隆抗体检测条带与羊抗鼠 IgG 多克隆抗体质控条带之间距离为5-7毫米。 

一种骨碱性磷酸酶检测试纸的制备方法，包括如下步骤： 

①胶体金垫的制备：

a. 用氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为30-50nm 的胶体金溶液；

b. 取100ml上述胶体金溶液，用0.2M的K₂CO₃溶液调节胶体金溶液至pH=9.0；

c. 将上述pH=9.0的胶体金溶液置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，按每100ml溶液加入0.5mg~1.5mg骨碱性磷酸酶抗体，缓慢滴加到胶体金溶液中；

d. 持续搅拌1小时后，加入浓度为10%~20%的BSA牛血清白蛋白至终浓度为0.2％和浓度为20%的PEG聚乙二醇20000至终浓度为0.1％，搅拌30分钟，以12000rpm的转速离心30分钟，弃上清，沉淀用pH=9.0的胶体金溶液复溶至76.5ml；

e. 按1ml溶液铺16cm²的比例将步骤d得到的溶液均匀地铺在无纺布上，再将无纺布置于温度20～25℃、湿度小于30％的干燥间干燥2～4 小时，制成胶体金垫；

②硝酸纤维素膜上检测条带和质控条带的制备：

将1mg/mL后的骨碱性磷酸酶多克隆抗体溶液用喷膜仪在硝酸纤维素膜上按1.0ul/cm 划线包被，构成检测条带；

将2mg/mL后的羊抗鼠IgG抗体溶液用喷膜仪在硝酸纤维素膜上按1.0ul/cm 划线包被，构成质控条带；

包被完成后，将硝酸纤维素膜置于干燥间干燥3～4 小时，即制成包被的硝酸纤维素膜；

③骨碱性磷酸酶联合检测试纸的装配：

在温度为20～25℃、湿度小于30％的干燥室内，取反应底板，将已包被的硝酸纤维素膜粘贴在底板的中部，在硝酸纤维素膜靠近检测条带的一侧搭接胶体金垫，在胶体金垫的另一侧搭接粘贴样品垫，在硝酸纤维素膜靠近质控条带的一侧距边缘搭接吸水滤纸；然后用裁剪机将贴好的底板切成宽度为3-5mm的试纸条。

本发明的有益效果如下：