[发明专利]一种全细胞转化高效生产α-苯丙酮酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种全细胞转化高效生产α-苯丙酮酸的方法，特别是以大肠杆菌表达重组脱氨酶基因，以此菌株转化L-苯丙氨酸生产α-苯丙酮酸，属于发酵工程领域。

背景技术

α-苯丙酮酸(PPA)是合成D-苯丙氨酸的原材料，D-苯丙氨酸是手性药物中间体。PPA还可用于制备苯乳酸，苯乳酸可作为抗菌物质。目前PPA生产主要是化学合成法，主要包括：乙酰氨基肉桂酸水解法、乙内酰脲与苯甲醛合成法和海因法。这些方法均需经过多步反应，对反应条件有较高要求，例如高压、高温等，产品得率低，对后期分离纯化加大了难度，易产生有毒有害产物。

L-氨基酸脱氨酶(EC1.4.3.2，L-AAD)催化L-氨基酸氧化脱氨基，生成相应α-酮酸和氨，多为黄素蛋白，二聚体结构。L-氨基酸脱氨酶主要存在于蛇毒和昆虫毒素中，在细菌、真菌、藻类中也存在。蛇毒氨基酸脱氨酶是研究最好的脱氨酶，但是价格昂贵，难以大规模使用。Proteus mirabilis KCTC2566有两种L-氨基酸脱氨酶，一种具有广泛的底物特异性，能够催化脂肪族和芳香族L-氨基酸，尤其对L-苯丙氨酸具有较高催化活性；另一种具有底物限制性，只对碱性氨基酸具有催化活性，尤其是L-组氨酸。大部分细菌L-氨基酸脱氨酶是胞外分泌型，但是这两种L-氨基酸脱氨酶都是膜蛋白。

在原核及真核生物中，20%-30%的基因编码膜蛋白，这些膜蛋白形成许多重要的超分子化合物。膜蛋白在许多疾病中发挥重要作用，将近半数药物的靶蛋白是膜蛋白。因此近些年，膜蛋白成为蛋白质组学及结构生物学的研究焦点。由于膜蛋白在双层膜上定位、插入以及正确折叠都是非常复杂的过程，表达系统的选择非常重要，膜蛋白表达有很多瓶颈尚未解决。

目前国外学者已对这两种L-氨基酸脱氨酶进行分离纯化及性质研究，但是目前尚未有利用此酶生产PPA的报道。

利用L-氨基酸脱氨酶为膜蛋白这一特性，我们开发了一种新的PPA生产模式-全细胞蛋白转化。全细胞转化相比分离酶具有如下优势：全细胞生物催化剂更容易制备，成本低；比分离酶更稳定，不易受环境温度、pH等因素影响，使用方便；转化过程中不产生有毒害产品，不产生其他副产物；转化过程一步生成PPA，不需经多步反应。相比之下现有某些化学合成法虽然得率能够达到90%以上，但是能耗高、步骤繁琐、污染严重。因此全细胞转化这一节能环保的生产方式具有极大潜力，有望实现低能耗、高效率、高纯度、无污染的工业化PPA生产。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种利用全细胞转化高效生产PPA的方法，是将来源于P.mirabilis KCTC2566的脱氨酶基因在大肠杆菌中异源表达，以此菌株高效转化L-苯丙氨酸生产PPA，从而解决了工业化PPA生产高成本、低得率、污染严重的问题。

所述P.mirabilis KCTC2566购买于Korea Collection for Type Cultures，KCTC。

所述大肠杆菌基因工程菌的构建是以P.mirabilis KCTC2566的基因组DNA为模板，PCR扩增核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的脱氨酶基因后连接到载体pET-20b(+)，将所得重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)。具体地，是以P.mirabilis KCTC2566基因组DNA为模板，使用如下引物扩增目的基因：

正向引物：5’CGCGGATCCATGAACATTTCAAGGAGAAAGCTAC3’，下划线部分为BamH I酶切位点；反向引物：5’CCGCTCGAGTTACTTCTTAAAACGATCCAAACTAA3’，下划线部分为Xho I酶切位点。PCR产物纯化、酶切后，与载体pET-20b(+)连接，构建重组质粒pET-pma。

所述基因工程菌全细胞转化高效生产α-苯丙酮酸的方法，是将种子培养液按1%的接种量接种到发酵培养基中，37℃培养至OD为1.0，添加终浓度0.4mM的IPTG，30℃诱导5h，收集细胞，取1.4-25.2g/L细胞、4-24g/L底物L-苯丙氨酸，pH5-9，25-45℃条件下，转化6-36h。优选底物L-苯丙氨酸浓度为14.0g/L，细胞浓度为8.4g/L，35℃，转化16h。