[发明专利]多片段DNA的酵母快速组装方法

说明书

本发明公开了一种多片段DNA的酵母快速组装方法，包括以下步骤：（1）将多个含有同源臂的DNA分子与线性化的酵母穿梭载体共转化酵母；（2）将整个筛选培养板上的全部转化后的酵母菌落洗脱下来，离心，弃上清，得到转化后的酵母菌细胞；（3）提取步骤（2）获得的酵母菌细胞的质粒DNA，转化大肠杆菌感受态细胞；（4）筛选大肠杆菌克隆，得到大片段DNA。本发明的方法组装大片段DNA分子的速度快、简便可行、成功率高、成本低，效率高、易操作，可将多个小片段DNA分子组装成一个大片段DNA分子，有利于进行工业化规模扩大，用途广泛。

技术领域

本发明涉及合成生物学领域，基因组合成技术，代谢工程领域，具体地是涉及多片段DNA的酵母快速组装方法及该方法合成的大片段DNA及应用。

背景技术

合成大片段DNA分子的技术意义重大，一方面可以用于合成基因组的结构单元，另一方面可以用于组装对人类有重大生产应用价值的代谢通路。

如今的生物学发展已经逐步进入全基因组合成时代，合成基因组学对于人们认识生命，改造生命更好的为人类社会服务有着重大意义。基因组合成是合成底盘细胞的重要方面，在设计方面：人工设计作为底盘生物必需的生长功能基因和表达功能基因及其碱基编码方式、这些基因最优化合理的连接方式和基因间调控；在合成方面：发展DNA大片段和染色体的高保真合成和组装技术，合成并组装基因组。2008年，J.Craig Venter小组又化学合成了生殖道支原体（Mycoplasma genitalium）的基因组，长度约580Kb；2010年，J.CraigVenter小组将人工设计、合成、组装好的丝状支原体（Mycoplasma mycoides）移植入受体细胞中，一段时间后，该移植细胞完全由合成的基因组控制；2011年Jef Boeke小组成功合成并导入了酿酒酵母9号染色体的右臂，合成基因组学开始进入真核细胞领域。

天然化合物是来源于生物体内的次级代谢产物，很多具有重要的生理活性及医疗保健作用，也是许多临床药物的源头。如二萜类化合物紫杉醇是著名的抗癌药；倍半萜类化合物青蒿素为当今最有效的抗疟药；丹参酮则是主要的心血管类中药。天然化合物需求巨大，传统生产方法这些传统方法工艺流程复杂、能耗高、污染大，而且对野生植物资源造成严重破坏。如今使用合成生物学的方法构建组装完整的天然化合物代谢途径在酵母菌或大肠杆菌等微生物中可以更为高效地合成这些天然化合物。加州大学伯克利分校的JayKeasling小组以大肠杆菌和酵母菌为宿主高效的生产青蒿素；MIT大学的GregoryStephanopoulos小组在大肠杆菌中生产紫杉醇前体物紫衫二烯已经达到1g/L。全合成天然化合物微生物代谢通路已成为世界热点领域。

对于DNA全合成技术，首先是通过PCR反应合成的，其长度往往小于1kb。当前，要将多个1kb的小片段组装一个大片段DNA分子最常用的组装DNA技术是通过重叠延伸PCR技术来将小片段DNA分子融合为大片段DNA分子，效率受到DNA聚合酶的扩增能力和保真性以及序列的二级结构。虽然已经有能够扩增较长片段的高保真DNA聚合酶（例如Phusion DNA聚合酶），但是当DNA大小超过6kb时反应已经变得很困难。传统的克隆技术主要是通过用内切酶消化得到含有互补粘性末端的两种DNA，并用DNA连接酶将这两种DNA分子拼接为一个DNA分子，这种方法每次只能组装两种DNA分子，如果要将多个DNA分子组装在一起就要做好多轮亚克隆，时间周期很长，而且反复的酶切连接反应会增加合成的成本。酵母细胞内部的同源重组机制已经得到广泛的研究，已被广泛用于构建酵母人工合成染色体（YACs）。一些研究表明酵母细胞可以摄入多个DNA片段，可装配四或者五个重叠的DNA片段连接到载体DNA上（Raymond，C.K.et.al.Biotechniques(1999)26:134‐138）。但是现有的酵母重组技术都要逐个挑取酵母单菌落培养筛选，线性化酵母载体要经过PCR获得（Gibson,DG.et.al.Science(2008)5867:1215‐1220），整体时间会相应的延长，保真度会下降，操作的复杂性和工作量都会增加。因此如何能够低成本，快速高通量筛选正确克隆成为酵母组装大片段DNA分子方法的关键技术。

发明内容