[发明专利]一种基于猪CD163基因的双荧光素酶报告基因载体

说明书

技术领域

本发明属于家畜基因工程技术领域，具体涉及一种基于猪CD163基因的双荧光素酶报告基因载体，该载体可以用于筛选检测调控猪CD163基因表达的候选microRNAs，探讨其抑制PRRSV感染增殖的作用，从而用于间接筛选抗猪繁殖呼吸综合征病毒感染的microRNAs，进一步用于microRNAs抗猪繁殖呼吸综合征的研究中。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS），因发病猪耳部发绀呈紫红色斑块状，又称“蓝耳病”，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染引起的一种危害极大的传染病，该病主要导致母猪繁殖障碍（流产、死胎和木乃伊胎增多等）、仔猪呼吸道症状和高死亡率、公猪精液品质下降等。自1987年首次在美国发现以来，几年之内PRRSV席卷了北美洲、欧洲、亚太地区和国家。Neumann评估PRRS每年使美国养猪业收入减少将近6亿美元，远远超过猪瘟和伪狂犬病的3.64亿美元和0.64亿美元。目前PRRS被公认为是危害养猪业的头号传染病。由于PRRSV破坏宿主免疫系统，导致持续感染；PRRSV变异性高，且感染致病的分子机理和免疫机制等尚不清楚，限制了安全高效疫苗和药物的研制，目前还没有一种疫苗能对猪体产生完全有效的保护。因此深入研究PRRSV致病及猪抗病机理、寻找防治PRRS新药设计的靶分子、培育抗病新品种（系）是当务之急。

CD163是PRRSV感染宿主细胞的关键受体之一，参与介导病毒的内吞和增殖。CD163是清道夫受体（Scavenger receptor cysteine-rich，SRCR）超家族成员之一，结构包含信号肽、9个串联的SRCR末端重复序列、一个跨膜区和胞质尾区。CD163是在2005年首次被发现与PRRSV感染有关，实验表明PRRSV非易感的系猪肾细胞表达CD163后，可以被PRRSV感染并产生病毒增殖能力。随后，Calvert等将从各种细胞系中分离获得的CD163分子转染到PRRSV非敏感的细胞系后，这些细胞内都产生子代病毒粒子，证明CD163确实是PRRSV感染有关的受体。猪肺泡巨噬细胞（PAM）是PRRSV的天然靶细胞，而采用CD163的抗体可以有效阻止PRRSV感染PAM。且有报道表明永生化后的PAM细胞系因无法正常表达CD163而变为PRRSV非易感细胞。CD163的表达量高低与PRRSV增殖率呈正相关，上调CD163表达（用IL-10处理）会增加病毒增殖，下调CD163表达（用TPA或LPS处理）可降低病毒增殖；并且采用CD163的抗体可以有效阻止PRRSV感染猪PAM细胞。本人参与的前期研究结果表明CD163基因的第11号外显子上SNP不同基因型与PRRSV抗体水平密切相关，这些SNP导致的氨基酸变化与PRRSV的感染有关。

MicroRNA（简称：miRNA）是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约为20-25个核苷酸，由具有发夹结构的70-90个碱基大小的单链RNA前体（pre-miRNA）加工而来，能够互补或部分互补的靶mRNA结合，使mRNA降解或介导其翻译抑制。这类小RNA在表达上具有组织和时间的特异性，它们介导了转录后的基因调控。成熟的miRNA可同时封闭多个靶基因的翻译，干预调节miRNA可改变多个靶基因的表达水平，且干预调节效率很高。越来越多的研究表明miRNA介导的基因调控对调节机体免疫功能具有重要作用。在人单核细胞中发现miR-146a在细菌诱发的天然免疫中起作用，而对以病毒为抗原的免疫反应无效。在人肺泡上皮细胞中，增加miR-146a的表达可对促炎因子IL-8和RNATES的释放有着负调节作用。在小鼠巨噬细胞中发现，miR-155在细菌和病毒诱导的免疫反应中均具有一定调节作用，缺少miR-155或其前体的实验小鼠，其获得性免疫应答呈现减弱状态，在血管内注射沙门杆菌typhimurium属后，无法建立相关的免疫应答，这种免疫应答的减弱可归咎于B细胞和T细胞功能损害以及树突状细胞的递呈缺陷。在免疫系统中，miRNAs在B淋巴细胞的早期分化及效应B淋巴细胞的分化过程中发挥了关键作用。在T淋巴细胞中，miRNA被发现是谱系诱导通路里的关键调节因子，同时也在调节性T细胞谱系的诱导，功能维持方面发挥了很重要的作用。miRNA在通过Toll样受体调节树突状细胞与巨噬细胞的分化过程中不可或缺，它能在细胞活化之前抑制其效应功能的发挥，并在刺激之后增强作用。可见，miRNA在免疫系统中起到关键调控作用，它甚至可能是细胞最原始的免疫方式。