[发明专利]一种基于猪CD163基因的双荧光素酶报告基因载体

权利要求书

1.一种基于猪CD163基因的双荧光素酶报告基因载体psi-CHECK2-CD163-3UTR，其特征在于：该载体包含SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，该序列位于猪CD163基因的3’UTR区。

2.一种扩增猪CD163基因cDNA3’末端的上游引物，其特征在于：所述引物的DNA序列如下所示：

外引物：CAGGTCGCTCATCTTTTGTTGC，

内引物：GCCTGAAAGCAGATGAAACGGA。

3.一种扩增猪CD163基因469bp片段的引物对，其特征在于：所述引物对的DNA序列如下所示：

上游引物：CCGCTCGAGTCGCTCATCTTTTGTTGC，

下游引物：ATTTGCGGCCGCTTTTATTTAATGCCCTTG。

4.一种用于非诊断目的的基于猪CD163基因的双荧光素酶报告基因载体psi-CHECK2-CD163-3UTR的制备方法，其特征在于：该载体通过以下步骤制备得到：

（1）参考猪CD163基因cDNA序列，利用cDNA3’末端快速扩增结合槽式降落PCR克隆获得猪CD163基因完整3’UTR片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

（2）利用生物信息学工具TargenScan，预测调控猪CD163基因表达的物种间保守microRNAs及靶位点序列，对比扩增的猪3’UTR区序列，寻找包含保守microRNAs的靶位点序列TGAATGT和AATGTGA；

（3）结合猪CD163基因CDS和SEQ ID NO：3所示核苷酸序列，设计包含microRNAs的靶位点序列的一对引物，该引物对的DNA序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示，利用PCR扩增猪CD163基因，得到如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列，其长度为469bp；

（4）将步骤（3）扩增的序列插入双荧光素酶报告基因载体psi-CHECK2中，通过酶切、连接、转化感受态细胞、筛选阳性克隆并测序验证、抽提重组质粒DNA并做双酶切鉴定，获得猪CD163基因双荧光素酶报告基因载体psi-CHECK2-CD163-3UTR，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。