[发明专利]一种改良共变性荧光原位杂交方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种荧光原位杂交技术，尤其涉及了一种改良共变性荧光原位杂交方法。

背景技术

荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization,FISH）是20世纪80年代末发展起来的一种重要的原位杂交方法，以非放射性荧光标记取代放射性同位素标记，而形成的一种新的分子细胞遗传学技术。FISH技术作为非放射性检测体系，与放射性同位素标记的探针相比具有明显的优势：

1.荧光试剂和探针较放射性同位素标记的探针更加经济安全；

2.探针稳定，一次标记后可在两年内使用；

3.实验结果灵敏度高，特异性好，定位准确；

4.多色FISH可通过在同一个核中显示不同的颜色，同时检测多种序列；

FISH技术不但可以用于已知基因或序列的染色体定位，而且可以用于动物、植物、微生物克隆基因或遗传标记及染色体畸变的研究，此外，FISH技术在基因定性、定量、整合和表达方面的研究中具有优势。但是，目前广泛使用的经典荧光原位杂交方法中，关键的杂交步骤操作复杂，步骤繁琐，极大地降低了实验效率，为实验带来了极大的不确定性，此外，经典杂交步骤中需要使用具有毒性的变性试剂，威胁了实验操作人员的身体健康，也给环境造成了危害。

发明内容

本发明针对经典荧光原位杂交技术操作复杂，步骤繁琐，实验效率低，且需要使用有毒致畸试剂的缺点，提供了一种操作简便，步骤简单、实验效率高，且不使用有毒致畸试剂的共变性荧光原位杂交方法。

为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决：

一种改良共变性荧光原位杂交方法，包括如下步骤：

步骤一制备玻片标本：样品经过EDTA-胰酶消化、低渗液处理、固定液固定处理后，滴片并烘烤，制得玻片标本；

步骤二探针与染色体共变性和杂交：在玻片标本上，滴加探针溶液，加盖盖玻片后，封盖盖玻片与载玻片间的交界缝后，烘烤玻片标本，使探针与样品染色体共变性，共变性完成后，将玻片标本置于湿盒中孵育；

步骤三杂交后洗涤并染色：孵育完成后，取出玻片标本，移除封盖盖玻片与载玻片间交界缝的胶水，用SSC洗涤液洗涤玻片标本后，染色处理；

步骤四信号检测：用荧光显微镜检测玻片标本。

经过前处理后的样本经EDTA-胰酶处理，EDTA（乙二胺四乙酸）作为螯合剂，结合金属离子，消除重金属离子对酶的抑制作用，EDTA-胰酶消化细胞外的蛋白质。样品浸入低渗液中，低渗液渗透压低于细胞内的渗透压，水分迅速进入细胞，使细胞膨胀，染色体铺展，使黏附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态，从而获得良好的染色体分裂相，有利于后续实验结果的观察，确保检测结果的准确性。固定液能迅速穿透细胞，将细胞固定并维持染色体结构的完整性，还能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。加入探针的玻片标本密封后，经过烘烤，高温使探针和待检测样品同时发生变性，染色体脱氧核糖核酸双螺旋结构解开，形成单链，变形完成后，温度降低，孵育探针和待检测样品，小分子探针与靶序列由于碱基互补配对结合，探针插入到待测样品中，指示靶序列的存在，指示染色体异常。杂交完成后，用SSC洗涤液洗涤玻片标本，洗去未结合的探针，避免未结合的探针显影，干扰检测结果。本发明的改良共变性荧光原位杂交中，探针与待检测样本的杂交过程不需经过乙醇的梯度脱水作用，免除了乙醇预冷冻等实验准备步骤，节约了大量试剂，降低了实验成本，此外，杂交过程不需要使用有毒的甲酰胺试剂，也免除了甲酰胺试剂的预热工作，有利于实验操作人员的身体健康，减少了环境污染，也极大地降低了实验操作复杂性，提高了实验效率，此外，简化实验步骤，也有利于提升检测结果的准确性。

作为优选，步骤一中，低渗液为氯化钾和柠檬酸钠的混合水溶液，固定液为甲醇和乙酸的混合液。低渗液渗透压低于细胞内液，水分迅速进入细胞，使其膨胀，同时可使黏附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态，获得分散良好的染色体分裂相。氯化钾和柠檬酸钠的混合水溶液作为低渗液，具有使染色体轮廓清楚，可染色性强，染色时间短的优点。固定液能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果，固定液为甲醇和乙酸混合配制成的固定液，可改变甲醇和冰乙酸的比例，冰乙酸比例增加，利于细胞膨胀、染色体铺展，但易导致细胞破裂、染色体散失，实际使用中，可根据预实验的结果调整以适应于不同的待检样品。