[发明专利]神经干细胞的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及再生医学领域。具体而言，涉及一种神经干细胞的制备方法。更具体而言，本发明涉及一种将间充质干细胞诱导为神经干细胞的方法。

背景技术

神经系统退行性病变的发病率逐年上升，主要表现为神经细胞的功能异常或细胞的进行性丢失，是临床常见的难治性疾病。对于机体自身而言，功能异常的神经细胞很难自行修复，而机体自身有限的神经再生能力亦不能满足修复损伤或细胞替代所需细胞数量的需求。目前，对于这些难治性疾病，临床上一般采用细胞营养疗法或药物治疗，但是收效甚微，尚未有安全有效的治疗方法。因此，对于神经系统退行性病变的治疗成为临床上一大难题。

随着再生医学的发展，干细胞移植疗法应运而生，受到人们的广泛关注。干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。我们可以在体外分离获得自体、同种异体或异种的干细胞，将其回输给患者，治疗相关疾病。干细胞移植疗法的提出为多种难治性或高发性疾病的治疗提供了新的途径，也为神经系统退行性病变的患者带来了新的希望。

神经干细胞（Neural stem cells，NSCs）是一种多能成体干细胞，能进一步分化为终末神经细胞类型，如神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。若将NSCs移植到损伤或病变部位，通过其在机体环境内的自发分化，替代功能受损或者凋亡的神经细胞，有望攻克上述医学难题，彻底治愈此类疾病。研究表明，直接将NSCs移植入受损小鼠损伤区域后，能明显减少神经凋亡，改善神经系统的运动功能，促进损伤区域的恢复，明显改善由神经元丢失所导致的认知功能障碍，因此NSCs是干细胞替代治疗神经系统疾病的理想种子细胞来源。

然而，NSCs的临床应用还存在诸多问题。首先，NSCs的来源困难，数量有限。目前，NSCs可由胚胎干细胞（Embryonic stem cells，ESCs）或诱导性多能干细胞（induced Pluripotent stem cells，iPSCs）分化而来，也可直接从成体神经组织中分离获得。然而ESCs和iPSCs的使用存在伦理及免疫排斥问题，且由于缺乏严格的筛选体系，ESCs或iPSCs来源的NSCs可能含有未分化完全的多能干细胞，其使用存在致瘤的风险。有学者尝试从胚胎或者成体脑组织中分离NSCs，但胚胎NSCs的使用同样不能回避伦理问题；在成体组织中，NSCs主要存在于大脑半球的海马及室管膜下区，不易分离提取，因此无论从胚胎还是成体组织中获得的NSCs，其来源有限，难以获得足够数量的细胞，不能满足临床治疗的需求。其次，虽然干细胞的免疫原性较低，但是异体来源的NSCs移植仍然存在免疫排斥问题，极大的影响移植的效果。最后，存在于成体脑组织不同区域的NSCs因分化阶段不同，具有不同的特性，这就对临床用药方案的制定及疗效的评估造成了一定的障碍，极大地限制了该疗法的推广应用。因此，寻找一种NSCs的新来源是目前急需解决的问题。

干细胞是一种具有自我更新能力和多系分化潜能的原始细胞，是细胞移植的理想细胞。在个体发育过程中，存在各种形式的干细胞，如胚胎干细胞、多能干细胞以及各种组织中的定向干细胞，如造血干细胞、神经干细胞等，但在实际应用上却面临伦理的挑战或取材的限制。间充质干细胞（MSC）是存在于人体组织中具有多系分化潜能的一种亚全能干细胞群，因其在特定环境下可诱导分化为多种组织细胞，且具有免疫原性低、移植后能形成稳定嵌合等特点，故可作为一种理想的供异基因移植的细胞。因为MSC亚全能干细胞可获得向内胚层组织分化的潜在能力、容易取材、来源更为丰富且不受伦理限制及没有成瘤危险，因此使用间充质干细胞体外诱导获得神经干细胞在临床上具有更高的应用价值。

发明内容

根据本发明的一方面，提供一种神经干细胞的制备方法，其包括步骤：

1）获得间充质干细胞；

2）将间充质干细胞在第一培养基中进行培养；

3）之后转入第二培养基中进行培养；

4）之后转入第三培养基中进行培养；

5）收集神经干细胞。

在一些具体的实施方式中，采用本领域常规方法获得间充质干细胞。

在一些具体的实施方式中，间充质干细胞是人脂肪来源的间充质干细胞。

在一些具体的实施方式中，间充质干细胞是使用本领域公知的分离培养方法获得的第3-5代间充质干细胞。在另一些具体的实施方式中，也可以使用市售的第3-5代间充质干细胞。

在一些具体的实施方式中，将间充质干细胞接种于第一培养基中，培养6-10天，优选8天，此时细胞体积变大，由梭形转变为上皮样细胞形态。