[发明专利]神经干细胞的制备方法

权利要求书

1.一种神经干细胞的制备方法，其包括步骤：

1)获得间充质干细胞；

2)将间充质干细胞在第一培养基中进行培养；

3)之后转入第二培养基中进行培养；

4)之后转入第三培养基中进行培养；

5)获得神经干细胞，

其中所述间充质干细胞是人脂肪来源的间充质干细胞；

其中所述第一培养基由动物细胞基础培养基、150ml/L至250ml/L血清替代物、5ml/L至15ml/L非必须氨基酸、0.05mmol/L至0.15mmol/Lβ-巯基乙醇、0.5mmol/L至1.5mmol/L L-谷氨酰胺和0ng/ml至10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子组成；

所述第二培养基由动物细胞基础培养基、5ml/L至15ml/L N2添加剂、10ml/L至30ml/L B27添加剂、0.05mmol/L至0.15mmol/Lβ-巯基乙醇和0.5mmol/L至1.5mmol/L L-谷氨酰胺组成；

所述第三培养基由动物细胞基础培养基、5ml/L至15ml/L N2添加剂、10ml/L至30ml/L B27添加剂、0.05mmol/L至0.15mmol/L β-巯基乙醇、0.5mmol/L至1.5mmol/L L-谷氨酰胺、15ng/ml至25ng/ml碱性成纤维细胞生长因子和15ng/ml至25ng/ml表皮细胞生长因子组成，其中

所述第一培养基的动物细胞基础培养基为Knockout DMEM或Knockout DMEM/F12，

所述第二培养基的动物细胞基础培养基为体积比为1：1的Neurobasal培养基与DMEM/F12培养基，以及

所述第三培养基的动物细胞基础培养基为体积比为1：1的Neurobasal培养基与DMEM/F12培养基；并且，其中

将所述间充质干细胞接种于所述第一培养基中，培养6至10天，

将完成步骤2)的细胞转接于第二培养基中，培养5至9天，

将完成步骤3)的细胞转接于第三培养基中，培养5至9天。

2.根据权利要求1所述的神经干细胞的制备方法，其中：

所述间充质干细胞是人脂肪来源的Flk-1阳性的间充质干细胞。

3.根据权利要求1所述的神经干细胞的制备方法，其中所述间充质干细胞是第3至5代的间充质干细胞。

4.根据权利要求3所述的神经干细胞的制备方法，其中所述间充质干细胞是第3代间充质干细胞。

5.根据权利要求1所述的神经干细胞的制备方法，其中

将所述间充质干细胞接种于所述第一培养基中，培养8天。

6.根据权利要求1所述的神经干细胞的制备方法，其中

将完成步骤2)的细胞转接于第二培养基中，培养7天。

7.根据权利要求1所述的神经干细胞的制备方法，其中

将完成步骤3)的细胞转接于第三培养基中，培养7天。

8.根据权利要求1所述的神经干细胞的制备方法，其中步骤2)至步骤4)的培养条件为：在37℃、50ml/L CO₂、空气相对湿度为95％的培养箱中培养。