[发明专利]八元瓜环自组装型分子信标及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种八元瓜环（CB[8]）自组装型分子信标及其制备方法和应用。

背景技术

1996年，Tyagi和Krammer设计了一种可以特异性识别核苷酸序列的新型荧光探针-分子信标（Molecular Beacon，MB），它是由寡核苷酸形成的发夹型分子，分子的一端标记荧光染料，另一端标记淬灭团。该探针与核苷酸靶分子杂交后发生构象变化而发出荧光，没有识别靶序列的MB不发荧光，可以不必从检测体系中分离出来，大大简化了操作。茎环结构使MB对靶序列的识别有很强的特异性，甚至可以区分单碱基错配。由于其独特的性质和多功能性，MB在短时间内即得到了迅速发展，广泛应用于实时定量PCR监测、核苷酸动态定量测定、活细胞成像以及DNA/蛋白质相互作用研究等，临床医学上用于SARS病毒、乙肝病毒及癌症诊断等，并且其应用领域仍在不断拓展。

随着MB应用研究的深入开展，特别是后基因组时代的到来，对细胞内mRNA的表达、折叠、运输和亚细胞定位的了解显得愈发重要，尤其是在单个活细胞内进行mRNA追踪，对于广大生物学家和化学家来说更是一个富有挑战性的课题。要想实现MB对活体mRNA的高灵敏检测，必须面对以下二个方面的挑战：第一是核苷酸酶对MB骨架的降解和破坏，其不可避免地产生假阳性信号（MB包括一段核苷酸片断，普通MB在细胞中稳定存在的时间大概为45分钟，随后细胞内核苷酸酶的酶切使荧光团与淬灭团分开，背景信号显著增强）；第二是灵敏度，尽管MB已经具有其他核苷酸探针无可比拟的灵敏度，但在不进行扩增的情况下，要实时监测单细胞内低丰度目标物，其灵敏度仍远远不够。

为解决上述问题，研究者开展了大量的工作。首先，为避免核苷酸酶降解，提高MB在细胞中的稳定性，尝试对MB的结构进行各种改造修饰。如采用2’-氧-甲基化碱基修饰MB、硫代修饰MB、肽核苷酸MB（PNA）等。但遗憾的是，2’-氧-甲基化碱基修饰的MB与蛋白质可以进行非特异性结合，在细胞内背景信号很强；硫代化MB本身毒副作用比较大；肽核苷酸MB受限于其溶解度和团聚现象，使其应用受到了限制。

提高灵敏度的研究则主要集中在增强荧光团的荧光强度和提高淬灭团的淬灭效率两个方面。在荧光团的改进方面，Tan研究组将具有高量子产率的水溶性聚电解质PPEs（Poly(phenylene ethynylene)）通过聚合反应联结到DNA的末端作为分子信标的荧光团，虽然增强了分子信标与靶分子结合后的荧光信号强度，一定程度上提高了检测灵敏度，但其合成相对复杂（Huang H.,et al.Design of a modular-based fluorescent conjugated polymer for selective sensing.Angewandte Chemie International Edition,2004,43:5635-5638）。Kim等设计了一种用巯基乙酸包覆的量子点作为荧光团的分子信标，但其灵敏度还有待提高（Kim J.H.,et al.Adaptation of inorganic quantum dots for stable molecular beacons.Sensors and Actuators B:Chemical,2004,102:315-319）。在提高淬灭团的淬灭效率方面，Tan研究组将多个淬灭团同时修饰在分子信标上形成超淬灭分子信标，与带有单个淬灭团的分子信标相比，其灵敏度提高了将近14倍，但其合成难度及加工成本显著增加（Yang C.J.,et al.Molecular assembly of superquenchers in signaling molecular interactions.Journal of the American Chemical Society,2005,127:12772-12773）。

发明内容

目前对分子信标性能的改进都是围绕其茎-环结构，以及对荧光团、淬灭团进行修饰和调整，但现有方法都不能同时解决核苷酸酶切带来的假阳性和提高灵敏度两个难题。其根本原因是，现有分子信标中荧光团和淬灭团与核苷酸的连接都是借助柔性的长链，两者在空间上的相对自由势必导致彼此不能最大限度靠近，而荧光团与淬灭团在空间上的充分靠近是其发生能量转移导致荧光淬灭的必要前提。

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种能同时解决这两个难题的八元瓜环自组装型分子信标，并提供该分子信标的制备方法和应用。