[发明专利]八元瓜环自组装型分子信标及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种八元瓜环自组装型分子信标，其特征在于，所述八元瓜环自组装型分子信标为发夹型分子，包括由核苷酸序列组成的茎-环结构、荧光团F和淬灭团Q、在带有荧光团F的一端有一个萘和/或其衍生物官能团、在带有淬灭团Q的一端有一个紫晶和/或其衍生物官能团、所述萘和/或其衍生物官能团及紫晶和/或其衍生物官能团通过静电吸引共同进入到八元瓜环的空腔内，其结构式如通式Ⅰ所示：

通式Ⅰ中，

表示由核苷酸序列组成的茎-环结构，其中环部分为与所要特异性识别的碱基序列成互补的单链碱基序列，茎部分为由5-8对互补的碱基序列组成的双链结构；

表示八元瓜环；

Ax、Ay各自独立地选自C_1-10烷基、C_1-10烷基氨基、C_1-10烷氧基、C_1-10酰胺基、C_1-10卤代烷基和(CH₂)_xO(CH₂)_y，其中x、y为1～10的整数；

F独立地选自荧光素类染料、罗丹明类染料、菁染料、二苯乙烯、萘酰亚胺、香豆素类、吖啶类、芳香烃类及其衍生物官能团中的任意一种；

Q独立地选自偶氮类染料及其衍生物官能团；

R₁、R₂、R₃和R₄各自独立地选自H、C_1-6烷基、CHO、COOH、NH₂、C_1-6烷基氨基、OH、SH、C_1-6烷氧基、C_1-6酰胺基、取代或未取代的苄基、卤素和C_1-6卤代烷基；m、n为1～10的整数。

2.一种用于制备八元瓜环自组装型分子信标的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）合成带有紫晶或其衍生物官能团及NHS酯活性基团的淬灭团

（a）中间体I的合成

将化合物a、EDC、NHS溶解在干燥四氢呋喃、乙腈、DMF或其混合溶剂中搅拌并加热至50-100℃，反应6-12 h后旋转蒸发除去溶剂，得到的油状物质用二氯甲烷溶解后，硅胶色谱柱层析分离，得到中间体I；

（b）中间体II的合成

将中间体I、三乙胺、DMAP在丙酮、乙腈、二氯甲烷或其混合溶剂中冰浴搅拌5-20 min，将对甲苯磺酰氯溶入二氯甲烷中，然后将该二氯甲烷溶液滴入上述反应液中反应过夜，旋转蒸发蒸干溶剂，用二氯甲烷溶解，再加入冰水洗涤，分液后干燥，得到二氯甲烷溶液，蒸干溶剂，残渣用二氯甲烷溶解后，硅胶色谱柱分离，得到中间体II；

（c）中间体III的合成

将中间体II、NaI加入丙酮、乙腈、四氢呋喃或其混合溶剂中，回流6-12 h，过滤除去固体，旋转蒸发除去溶剂，用二氯甲烷溶解后用硅胶色谱柱分离，得到中间体III；

（d）淬灭团IV的合成

将中间体III与带有取代基R₂的单边紫晶衍生物b溶入干燥乙腈、DMF或其混合溶剂中，氮气保护下回流12-48h，反应结束后过滤，用CH₂Cl₂洗涤，得到淬灭团IV；

（2）合成带有萘或其衍生物官能团及2-氰乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺的荧光团

（a）中间体V的合成

将化合物c和d溶于乙二醇单甲醚、DMF或其混合溶剂中，氮气保护下回流6-12h，停止反应后旋转蒸发除去溶剂，用CH₂Cl₂溶解固体，硅胶柱层析得到中间体V；

（b）荧光团VI的合成

分别将中间体Ⅴ和2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺e溶解在干燥二氯甲烷、四氢呋喃、乙腈或其混合溶剂中，先向V溶液中加入N,N-二异丙基乙胺，再在氮气保护下缓慢滴加2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺溶液，室温反应10-60min后，反应液用饱和NaHCO₃溶液洗涤，有机相用无水Na₂SO₄干燥，过滤后旋转蒸发除去溶剂，硅胶柱层析纯化得到荧光团VI；

（3）八元瓜环自组装型分子信标的制备

（a）核苷酸序列的合成

采用常规的固相亚磷酰胺三酯法在DNA自动合成仪上得到需要的核苷酸序列；

（b）在核苷酸序列的5’端连接荧光团

经过脱DMT、偶联、封闭、氧化四步反应将荧光团VI连接到核苷酸序列上，然后用25%的浓氨水于55-75℃下反应8-15h进行氨解，将核苷酸序列从CPG上切除下来同时脱掉荧光团VI上的氰乙基保护基，将得到的溶液在冰上冷却，真空除去氨，离心除去CPG后即可得到5’端带有荧光团的核苷酸序列；

（c）在核苷酸序列的3’端连接淬灭团

在核苷酸序列的3’-OH端修饰上一个带Ax’的氨基末端，然后与带有NHS酯活性基团的淬灭团IV反应，经HPLC分离纯化，得到在核苷酸序列的5’端、3’端分别连接荧光团和淬灭团的核苷酸序列，即新型MB；

（d）将该新型MB与八元瓜环的水溶液混合，萘和/或其衍生物官能团及紫晶和/或其衍生物官能团通过静电吸引共同进入到八元瓜环的空腔内，得到八元瓜环自组装型MB；

上述各反应式中，

Ax、Ay各自独立地选自C_1-10烷基、C_1-10烷基氨基、C_1-10烷氧基、C_1-10酰胺基、C_1-10卤代烷基和(CH₂)_xO(CH₂)_y，其中x、y为1～10的整数；

Ax’为Ax的反应前体；

F独立地选自荧光素类染料、罗丹明类染料、菁染料、二苯乙烯、萘酰亚胺、香豆素类、吖啶类、芳香烃类及其衍生物官能团中的任意一种；

Q独立地选自偶氮类染料及其衍生物官能团；

R₁、R₂、R₃和R₄各自独立地选自H、C_1-6烷基、CHO、COOH、NH₂、C_1-6烷基氨基、OH、SH、C_1-6烷氧基、C_1-6酰胺基、取代或未取代的苄基、卤素和C_1-6卤代烷基；

m、n为1～10的整数；

X表示卤素；

表示CPG微珠，表示八元瓜环。

3.权利要求1所述的八元瓜环自组装型分子信标在特异性识别核苷酸序列中的应用。