[发明专利]人细小病毒B19三种基因型的实时荧光定量PCR检测方法及其通用检测引物、TaqMan探针与试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中核酸的分子生物学检测方法，特别是涉及人细小病毒B19三种基因型的实时荧光定量PCR检测方法及其通用检测引物、TaqMan探针与试剂盒。

背景技术

人细小病毒B19（B19病毒）与输血安全和血液制品的病毒安全性密切相关。B19病毒是目前确认的唯一可致人类疾病的细小病毒。B19病毒感染后临床表现多样。儿童B19病毒感染以传染性红斑（EI）多见，又称“第五病”。成人感染常为隐性感染，或者仅出现轻微发热、头痛等类似感冒的症状，免疫功能缺陷患者感染可以导致慢性贫血，血液病人感染可以引起短暂性再生障碍危象（TAC），孕妇感染则可以导致流产、死产和水肿性死胎等。B19病毒感染还可以引发很多并发症，包括嗜血细胞综合征、肺炎、肾小球肾炎、神经系统症状、肝炎、过敏性紫癜、血管炎、心肌炎、心包炎等。除上述症状和疾病外，B19病毒还被认为与多种自身免疫病有关，包括系统性红斑狼疮、巨细胞动脉炎、结节性多动脉炎、特发性血小板减少性紫癜等。

B19病毒急性感染期，患者血液中病毒含量可高达10¹¹～10¹⁴拷贝/mL。部分病毒感染者经过急性感染期后，病毒不被清除而形成持续感染，血液中病毒含量在10³～10⁷拷贝/mL之间，病毒在体内持续时间可长达几个月甚至几年。

B19病毒传播途径除主要经呼吸道传播外，也可通过输血、血液制品传播，且因为接受输血和应用血液制品的人群常常有血液病、免疫缺陷或其它疾患存在，病毒感染后更容易导致疾病的发生。因此，血液、血制品感染途径具有更重要的临床意义。

近年来，国际组织及发达国家对于原料血浆及血液制品中B19病毒的污染均采取了一定的监控措施。国际血浆蛋白治疗协会（PPTA）是全球血浆采集和治疗产业的代表机构。PPTA在2003年制定相关标准：混合血浆中细小病毒B19DNA含量不能超过10⁵IU/mL，并将核酸检测技术（nucleic acid amplification technology，NAT）作为检测B19病毒载量的一种在线控制措施执行。美国食品与药品监督管理局（FDA）于2009年建议混合血浆中B19病毒的含量控制在＜10⁴IU/mL的水平，将NAT方法作为在线控制措施，并且要求使用的NAT技术能检出B19病毒的全部基因型（即能同时检出B19病毒的三种基因型）。欧洲药典对于抗D免疫球蛋白及S/D灭活血浆也做出要求，B19病毒载量低于10⁴IU/mL。

NAT是一种新兴的血液传染病检测方法，其敏感性和特异性均很高，可用于B19病毒感染的早期诊断及B19病毒分子流行病学调查。除此之外，还被血液制品生产企业用来进行原料血浆和血液制品生产的质量控制。目前，国内外常用来检测B19病毒的NAT技术主要为聚合酶链反应技术（polymerase chain reaction，简称PCR）和实时荧光定量PCR技术。

PCR是一种利用DNA变性和复性原理在体外进行特定的DNA片段高效扩增的技术，可检出微量靶序列。在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。仅需用极少量模板，在一对引物介导下，可扩增至100万-200万份拷贝。PCR反应分三步：变性、退火及延伸。以上三步为一循环，每一循环的产物作为下一个的模板，这样经过多个循环，可得到大量复制的特异性DNA片段。

实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、自动化程度更高、可有效解决PCR污染问题等特点，目前已得到广泛应用。所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。