[发明专利]人细小病毒B19三种基因型的实时荧光定量PCR检测方法及其通用检测引物、TaqMan探针与试剂盒

权利要求书

1.用于对人细小病毒B19（B19病毒）三种基因型进行实时荧光定量PCR检测的通用型引物，其上游引物（命名为P(NS1-1)）的核苷酸序列如序列表中SED ID NO：1所示，下游引物（命名为P(NS1-2)）的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示；或，

由SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2经过一至十个碱基的取代、缺失或添加得到的衍生序列表示的引物。

2.用于对B19病毒三种基因型同时进行实时荧光定量PCR检测的TaqMan探针，命名为TaqManProbe(NS1)，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。

3.根据权利要求2所述的TaqMan探针，其特征在于：所述探针为经过荧光标记的，其5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团；所述报告荧光基团可为HEX、FAM，优选为HEX；所述荧光淬灭基团可为ECLIPSE、TAMRA，优选为ECLIPSE。

4.根据权利要求2或3所述的TaqMan探针，其特征在于：所述探针的3’端还需经磷酸化处理。

5.根据权利要求2或3或4所述的TaqMan探针，其特征在于：由上述TaqMan探针序列的衍生序列表示；所述衍生序列是指在SEQ ID NO：3的基础上，在序列的5’端和/或3’端再添加、减少一个或多个碱基得到的序列。

6.一种同时检测B19病毒三种基因型的实时荧光定量PCR检测试剂盒，包含有权利要求1所述的通用型引物和权利要求2-5任一所述的TaqMan探针。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：为将用于对人细小病毒B19（B19病毒）三种基因型进行实时荧光定量PCR检测的引物、TaqMan探针混合液120μL（含P(NS1-1)48μL，P(NS1-2)48μL，TaqManProbe(NS1)24μL）、定量PCR反应Mix液（Platinum Quantitative PCR SuperMix-UDG）480μL、B19-pUC19标准品（1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹拷贝/μL4个梯度，每个梯度各30μL）、和阴性对照（B19病毒核酸阴性的血浆）150μL共同包装，得到可同时对人细小病毒B19（B19病毒）三种基因型进行定性、定量检测的实时荧光定量PCR检测试剂盒。

8.一种针对原料血浆和血液制品用权利要求6或7所述实时荧光定量PCR检测试剂盒同时对B19病毒三种基因型进行检测的方法，包括以下步骤：

1）标准曲线的建立：用携带121bp B19病毒NS1基因保守区的质粒作为标准品，梯度稀释成1×10¹⁰、1×10⁹、1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²拷贝/μL，将质粒作为模板，在试剂盒中通用型引物和TaqMan探针的引导下进行B19病毒NS1基因的实时荧光定量PCR检测，检测结束后，以标准品浓度为横坐标、以荧光信号强度为纵坐标绘制标准曲线；

2）以原料血浆或血液制品为检测样本，提取检测样本的DNA，以提取的DNA为模板，在试剂盒中通用型引物和TaqMan探针的引导下进行B19病毒NS1基因的实时荧光定量PCR检测；

3）根据检测样本的荧光信号的变化及强度，对样本中的B19病毒NS1基因进行定性、定量检测，出现荧光扩增曲线表明样本中含有B19病毒NS1基因，未出现荧光扩增曲线表明样本中不含有含有B19病毒NS1基因，再根据样本的荧光信号强度和步骤1）中的标准曲线，得到样本中B19病毒NS1基因的含量。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：所述步骤1）和步骤2）中的20μL实时荧光定量PCR反应体系可包括：1×Platinum Quantitative PCR SuperMix-UDG10μL，500nM P(NS1-1)1μL，500nM P(NS1-2)1μL，250nMTaqManProbe(NS1)0.5μL，模板3μL，加ddH₂O至20μL。

10.根据权利要求8或9所述的检测方法，其特征在于：所述步骤1）和步骤2）中的实时荧光定量PCR反应条件可为：先50℃2min，95℃2min；然后95℃9s、60℃30s，共40个循环。在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。