[发明专利]枯草芽孢杆菌基因组无痕修饰方法

说明书

技术领域

本发明属于基因组改造技术领域，具体地涉及一种枯草芽孢杆菌基因组无痕修饰方法。 

背景技术

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是存在于土壤和植物微生态系统中的优势微生物种，广泛存在于自然界。无致病性，对人畜无害，不污染环境，具有较强的抗逆能力和抗菌防病作用，被广泛用为分子生物学研究模式生物以及工业化生产高产菌株宿主。近年來，随着第二代和第三代高通量测序技术的快速发展，处于功能基因组时代的比较基因组测序，逆向代谢工程，适应性进化等方面分子生物学研究迫切需要一种快速，无痕，高效的等位基因置换和基因组修饰工具。 

枯草芽孢杆菌虽然在自然条件下也可形成感受态吸收外源DNA，但是通常形成时期是处于对数生长末期开始形成，而通常形成感受态的比例不高，约占5%～15%。这直接导致外源DNA转化效率较低，加大了基因操作的难度。目前，应用于枯草芽孢杆菌感受态制备的方法有多种，如Spizizen转化、噬菌体转导，原生质体转化和电转等。以传统的Spizizen转化方法为例，该方法主要原理是，使枯草芽孢杆菌生长在相对贫瘠的培养基中，诱导细胞形成自然感受态能力，这种技术较成熟，但是具有转化效率低，制备过程复杂，培养基配制过程不易等缺点。另外几种方法虽然具有较高的转化效率，但是制备过程过于复杂。目前已经有文献表明，处于枯草芽孢杆菌感受态形成过程中ComK蛋白的强表达可以进一步激活自身的转录而大幅度提高其在胞内的浓度，并且激活晚期感受态基因（包括与DNA吸附、吸收和重组的有关的基因）开始转录，可大幅度的提高细胞形成感受态的比率，对于外源DNA的转化效率已经可以达到10³ cfu/μg dsDNA。 

正负选择系统是基因组修饰的常用筛选方法之一，为了更好地筛选发生同源重组的阳性转化子，1988年Mansour等人设计了正负双向选择系统（Positive-Negative Selection，PNS），解决了定点整合与随机整合的鉴别问题。常用的正选择标记有：氯霉素（crm）、新霉素磷酸转移酶（neo）、潮霉素B磷酸转移酶（hph）、黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸转移酶（gpt）、次黄嘌呤磷酸转移酶（Hprt）、胸腺嘧啶激酶（tk）及嘌呤霉素乙酰转移酶（puro）等。常用的负选择标记基因有mazF、blaI、ysbC、hwel、upp等。其中，mazF用时间长之后会积累产生抗mazF敏感性菌株的可能性，blaI和ysbC需要宿主细胞为对应的营养缺陷型菌株，而hwel为来自真核细胞表达蛋白，在原核细胞内的表达需要精心的拼接和密码子优化修饰，应用上较为繁琐。而upp为枯草芽孢杆菌内源基因，编码尿嘧啶磷酸核糖基转移酶（UPRTase），催化尿嘧啶生成尿苷单磷酸（UMP），从而利用胞外尿嘧啶。嘧啶类似物5-氟尿嘧啶（5FU）也能够被UPRTase催化生成5-F-dUMP，而5-F-dUMP是枯草芽孢杆菌胸苷酸合成酶的强烈抑制剂，会导致细胞死亡。枯草芽孢杆菌upp基因缺失突变株可以在低浓度（10-20μM）的5FU负筛选 培养基上生长，因此可以将upp基因作为负筛选标记。 

传统应用upp基因的枯草芽孢杆菌高效基因组修饰的技术方法是：首先构建枯草芽孢杆菌upp缺失宿主菌，其次将upp基因和抗性基因连接在一起组成“upp通用盒子”，然后将目标基因上下游同源臂与upp基因通过融合PCR方法融合为dsDNA片段，进一步通过同源重组方式将dsDNA片段整合至upp缺失枯草芽孢杆菌基因组。利用抗性基因筛选阳性转化子，最后通过细胞内同源臂的第二次分子内同源重组弹出upp基因，利用5FU负筛选培养基筛选阳性转化子并通过测序进行验证。该方法存在一些缺陷：一方面，枯草芽孢杆菌感受态细胞对于外源DNA的吸收能力较低（如Spizizen方法），导致外源DNA第一次基因重组效率较低；另一方面，整个基因组修饰过程涉及到的第二次分子内的基因重组仅为负筛选，假阳性率较高，给菌株筛选带来一定难度；同时第二次分子内同源重组的效率较低，文献报道仅为10^-7～10^-6数量级左右，同样很难筛选出阳性重组菌株。 

发明内容

本发明的目的是解决现有技术中存在的问题，提供一种能显著提高分子内重组效率并且不留下任何筛选标记的枯草芽孢杆菌基因组无痕修饰方法。 

本发明的第二个目的是提供第二种枯草芽孢杆菌基因组无痕修饰方法。 

本发明的技术方案概述如下：