[发明专利]枯草芽孢杆菌基因组无痕修饰方法

权利要求书

1.一种枯草芽孢杆菌基因组无痕修饰方法，其特征是包括如下步骤：

（1）构建含有I-SceI酶切位点的模板质粒pSS、温度敏感型I-SceI表达质粒pEBS-copl和含有ComK诱导表达系统整合质粒pST；所述质粒pSS含有正筛选标记基因cat，负筛选标记基因upp和I-SceI酶切识别位点；

（2）将所述质粒pST整合至菌株B.subtilis168，获得了upp缺失和ComK表达系统整合菌株BTK；

（3）将所述质粒pEBS-copl转化至所述菌株BTK，获得无痕修饰出发菌株BUK；

（4）以所述质粒pSS为模板，通过PCR获得正负筛选盒子；以枯草芽孢杆菌基因组为模板，通过PCR获得目标操作基因的含有DR序列的上游同源臂F和含有DR序列的下游同源臂B；将所述含有DR序列的上游同源臂F、正负筛选盒子和含有DR序列的下游同源臂B通过融合PCR得到目的dsDNA片段1；

（5）阿拉伯糖诱导无痕修饰出发菌株BUK形成感受态细胞；用所述dsDNA片段1转化至所述感受态细胞中，通过正筛选标记氯霉素抗性来筛选发生双交换基因重组的阳性转化子BUK-I；

（6）将所述发生双交换基因重组的阳性转化子BUK-I接种于LB液体培养基，在培养过程中加入木糖，通过木糖诱导核酸内切酶I-SceI表达，得到基因组上DNA双链断裂，发生分子内同源重组删除两DR区之间所有的筛选标记的细胞，涂布于5FU负筛选平板上筛选出基因组无痕修饰的阳性菌株BUK-II。

2.一种枯草芽孢杆菌基因组无痕修饰方法，其特征是包括如下步骤：

（1）构建含有I-SceI酶切位点的模板质粒pSS、温度敏感型I-SceI表达质粒pEBS-copl和含有ComK诱导表达系统整合质粒pST；所述质粒pSS含有正筛选标记基因cat，负筛选标记基因upp和I-SceI酶切识别位点；

（2）将所述质粒pST整合至菌株B.subtilis168，获得了upp缺失和ComK表达系统整合菌株BTK;

（3）将所述质粒pEBS-copl转化至所述菌株BTK，获得无痕修饰出发菌株BUK;

（4）以所述质粒pSS为模板，通过PCR获得正负筛选盒子；以枯草芽孢杆菌基因组为模板，通过PCR分别获得目标删除区域的上游同源臂A、上游同源臂C和下游同源臂E；将上游同源臂A、下游同源臂E、正负筛选盒子和上游同源臂C通过融合PCR得到融合dsDNA片段2；

（5）阿拉伯糖诱导无痕修饰出发菌株BUK形成感受态细胞；用所述dsDNA片段2转化至所述感受态细胞中，通过正筛选标记氯霉素抗性来筛选发生双交换基因重组的阳性转化子BUK-III；

（6）以质粒pDK为模板，通过PCR获得Kan基因并引入I-SceI酶切识别位点；以枯草芽孢杆菌基因组为模板，通过PCR分别获得目标删除区域的下游同源臂D和下游同源臂E；将下游同源臂D、含有I-SceI酶切识别位点的Kan基因和下游同源臂E通过融合PCR得到融合dsDNA片段3；

（7）阿拉伯糖诱导菌株BUK-III形成感受态细胞；用所述dsDNA片段3转化至所述感受态细胞中，通过正筛选标记卡那霉素抗性来筛选发生双交换基因重组的阳性转化子BUK-IV；

（8）将所述阳性转化子BUK-IV接种于LB液体培养基，在培养过程中加入木糖，通过木糖诱导核酸内切酶I-SceI表达，得到基因组上DNA双链断裂，发生分子内同源重组删除同源臂E之间所有的筛选标记的细胞，涂布于5FU负筛选平板上筛选出基因组无痕修饰的阳性菌株BUK-V。