[发明专利]一种转录激活子样效应因子核酸酶的内源活性检测方法

说明书

技术领域

    本发明涉及一种转录激活子样效应因子核酸酶的检测方法，特别涉及一种转录激活子样效应因子核酸酶的内源活性检测方法。

背景技术

目前用于检测转录激活子样效应因子核酸酶（transcription activator-like effector nucleases, TALENs）活性的方法，有如下3种： 

靶点酶切检测：该方法将TALEN质粒转染细胞系（GFP质粒共转染观察转染效率），提取转染后细胞的基因组，通过聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）扩增目的DNA，将PCR扩增的DNA片段经限制性酶切，凝胶电泳检测，未打断序列为敲除成功，计算灰度值与对照组相比。该方法的局限性为：（1）TALEN设计时必须已考虑将靶点选择在有特异酶切位点的区域；（2）若FOLK酶剪切位点在酶切位点以外的部分，内切酶仍可发挥作用，检测不到这样的敲除，检测敲除效率的结果比实际偏低。 

SURVEYOR突变检测：该方法将TALEN质粒转染细胞系（GFP质粒共转染观察转染效率），提取转染后细胞的基因组，通过PCR扩增目的DNA，将PCR扩增的DNA片段加入外源DNA后将混合物解链-退火，得到异源多聚DNA片段，用异源多聚检测酶（SURVEYOR Nuclease）按试剂盒步骤进行检测，凝胶电泳显示结果，分析结果得到敲除效率。该方法的局限性为：（1）对PCR产物要求高；（2）敲除效率取决于异源多聚DNA片段的形成比例，不能直接反应确切的敲除效率。

Luciferase SSA检测：首先在luciferase的编码区中央插入一个终止子， 此时luciferase 没有活性。将TALEN剪切的靶点位置序列插在终止子后，在TALEN的剪切作用下，靶点位置双链断裂，细胞通过同源重组方式修复DNA，终止子一并剪切掉，重组的luciferase具有活性。通过与参照的比值变化反应TALEN剪切的活性水平。该方法的局限性为：（1）只检测了TALEN的外源性活性，未在特定种属检测其是否具有内源活性；（2）通过参照比较荧光素活性的高低，只能反映TALEN是否具有活性，而敲除效率的高低不能反映。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种转录激活子样效应因子核酸酶的内源活性检测方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种转录激活子样效应因子核酸酶的内源活性检测方法，包括如下步骤：针对所研究目的基因的外显子序列设计靶位点，构建TALEN质粒对；将TALEN质粒对显微注射至受精卵的原核或将TALEN质粒对体外转录为mRNA显微注射至受精卵胞质内；将注射成功的受精卵体外培养；巢式PCR扩增培养得到的单个胚胎的目的基因；将经琼脂糖凝胶电泳鉴定的PCR产物进行测序，根据测序套峰出现的比例判断TALEN质粒的敲除效率，即可判断TALEN质粒内源活性的高低。

所述的靶位点的设计优选为包括如下原则：（1）5’端固定碱基T；（2）从5’端起，第1位碱基不能为T，第2位碱基不能为A；（3）GC含量小于40%；(4) 3’端不能为G；（5）左、右臂靶位点16-19bp；（6）左右臂靶位点间隔18-24bp。

所述的受精卵优选为斑马鱼、大鼠、小鼠或猴等的受精卵。

所述的受精卵优选为通过如下方法获取：雌性大鼠超数排卵后，颈椎脱臼处死，75%（v/v）酒精消毒后剪开腹腔，剪下输卵管置于37℃预热的M2液滴中，体式镜下用尖镊将输卵管壶腹部划开，释放出卵丘-卵母细胞复合体；用透明质酸酶消化卵细胞周围的颗粒细胞，M2洗3-5次后，移入覆盖有矿物油的M16培养液中，置于37℃，5%的CO₂培养箱培养；取出卵细胞置于显微镜下观察，选出可见清晰原核的受精卵用于显微注射。

所述的显微注射的方法优选为：安装拉制好的持卵针，持卵针通过塑料管连接于装有矿物油的带微调的注射器，通过调节油泵控制卵的位置；安装虹吸有质粒或mRNA的注射针，注射针通过塑料管连接有压力泵的注射仪；根据注射针的出液量调节注射压力，以可见胞质内有明显膨胀而细胞仍能存活为适宜注射量。