[发明专利]一种转录激活子样效应因子核酸酶的内源活性检测方法

权利要求书

1.一种转录激活子样效应因子核酸酶的内源活性检测方法，其特征在于包括如下步骤：针对所研究目的基因的外显子序列设计靶位点，构建TALEN质粒对；将TALEN质粒对显微注射至受精卵的原核或将TALEN质粒对体外转录为mRNA显微注射至受精卵胞质内；将注射成功的受精卵体外培养；巢式PCR扩增培养得到的单个胚胎的目的基因；将经琼脂糖凝胶电泳鉴定的PCR产物进行测序，根据测序套峰出现的比例判断TALEN质粒的敲除效率，即可判断TALEN质粒内源活性的高低。

2.根据权利要求1所述的转录激活子样效应因子核酸酶的内源活性检测方法，其特征在于：所述的靶位点的设计包括如下原则：（1）5’端固定碱基T；（2）从5’端起，第1位碱基不能为T，第2位碱基不能为A；（3）GC含量小于40%；(4) 3’端不能为G；（5）左、右臂靶位点16-19bp；（6）左右臂靶位点间隔18-24bp。

3.根据权利要求1所述的转录激活子样效应因子核酸酶的内源活性检测方法，其特征在于：所述的受精卵为斑马鱼、大鼠、小鼠或猴的受精卵。

4.根据权利要求1所述的转录激活子样效应因子核酸酶的内源活性检测方法，其特征在于：所述的受精卵通过如下方法获取：雌性大鼠超数排卵后，颈椎脱臼处死，75%酒精消毒后剪开腹腔，剪下输卵管置于37℃预热的M2液滴中，体式镜下用尖镊将输卵管壶腹部划开，释放出卵丘-卵母细胞复合体；用透明质酸酶消化卵细胞周围的颗粒细胞，M2洗3-5次后，移入覆盖有矿物油的M16培养液中，置于37℃，5%的CO₂培养箱培养；取出卵细胞置于显微镜下观察，选出可见清晰原核的受精卵用于显微注射。

5.根据权利要求1所述的转录激活子样效应因子核酸酶的内源活性检测方法，其特征在于：所述的显微注射的方法为：安装拉制好的持卵针，持卵针通过塑料管连接于装有矿物油的带微调的注射器，通过调节油泵控制卵的位置；安装虹吸有质粒或mRNA的注射针，注射针通过塑料管连接有压力泵的注射仪；根据注射针的出液量调节注射压力，以可见胞质内有明显膨胀而细胞仍能存活为适宜注射量。

6.根据权利要求1所述的转录激活子样效应因子核酸酶的内源活性检测方法，其特征在于：所述的体外培养的条件为：将注射成功的受精卵用大鼠胚胎培养液37℃，5%的CO₂培养箱培养隔天换液，培养3-5天后用于扩增目的基因检测；所述大鼠胚胎培养液的配方为：葡萄糖7.5 mmol/L，L-谷氨酰胺1 mmol/L，NaCl 77 mmol/L，KCl 1.34 mmol/L，MgCl₂ 0.44 mmol/L，CaCl₂ 1.78 mmol/L，NaHCO₃ 25 mmol/L，丙酮酸钠0.59 mmol/L，乳酸钠25 mmol/L，牛血清白蛋白0.3%。

7.根据权利要求1所述的转录激活子样效应因子核酸酶的内源活性检测方法，其特征在于：所述的敲除效率的计算公式为：敲除效率=出现套峰样本数/总的测序样本数×100%。