[发明专利]利用大肠杆菌原核表达系统生产的小麦蛋白质二硫键异构酶及方法和应用

说明书

技术领域

本发明设计利用大肠杆菌原核表达系统生产小麦蛋白质二硫键异构酶的方法及在面粉加工中的应用，属于微生物、分子生物学、基因工程及谷物化学领域。

背景技术

小麦是重要的粮食作物，为全球近40%人口提供主要粮食，我国小麦产量占世界总产量的六分之一。小麦面粉既具有良好的营养功能，又能加工成不同需求、适口性好、外形美观的面制品。麦谷蛋白在面团中所形成的网络结构赋予小麦面粉以加工品质，麦谷蛋白亚基间二硫键则是网络结构形成的基础，因此，面粉的加工品质与麦谷蛋白聚集体中二硫键的数量和质量密切相关。

与世界其它国家相比，我国小麦的加工品质较差，改良小麦加工品质是小麦育种领域和谷物化学领域一直致力于解决的关键问题之一，而且，随着人们对食品加工品质的要求不断提高，控制并提高加工品质已成为面制品加工产业的重要任务之一。二氧化氯、过氧化钙等“化学”氧化还原剂能影响面筋网络的形成和性质，改变面筋强度，是谷物加工领域较为普遍应用的面粉改良剂。由于“化学”面粉改良剂有可能带来潜在的食品安全问题，天然、安全的面粉改良剂越来越受到面制品加工领域的青睐。

小麦面粉中内源酶之一——小麦蛋白质二硫键异构酶（Wheat Protein Disulfide Isomerase，wPDI）能催化蛋白质二硫键的形成和正确配对。蛋白质二硫键异构酶（PDI）是一种属于硫氧还蛋白家族、存在于各种真核生物细胞内质网中的氧化还原酶，具有催化二硫键形成的氧化活性、促使错误配对的二硫键重排的异构酶活性及指导蛋白质正确折叠的分子伴侣活性，对维持蛋白质分子的稳定性和功能具有不可替代的作用。

在国际上，小麦PDI（wPDI）应用于改善面粉加工特性有零星报道。Every 等从小麦麸皮和胚芽等组织中分离wPDI，通过面包烘焙实验证明PDI在微量抗坏血酸存在的条件下能改善面包的烘焙品质，但没有添加抗坏血酸时则未见对面包品质有明显的改进，而日本的高野克己等发现仅使用E.coli（大肠杆菌）重组wPDI对面包的烘焙品质仍然具有改进作用，而且，在黄素蛋白和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）协同下，可以大大提高wPDI改善面团加工品质的能力。一般认为，wPDI改善面粉加工品质是通过PDI氧化活性催化麦谷蛋白之间形成二硫键的交联网状结构实现的，而添加氧化还原剂（FAD、抗坏血酸）则可以有效地向wPDI提供氧化当量，提高PDI氧化二硫键形成的效率。

PDI在小麦中的含量较少，通过提取分离纯化不仅得率低且工艺复杂，近年来，已有通过原核表达的方法获得小麦PDI的文献报道，但原核表达的量依然很低，且要进行几种组合的层析方式才能达到较高纯度，且酶活损失严重。

发明内容

为了解决上述问题，本发明通过大肠杆菌表达系统，实现了大量表达wPDI，并通过一次柱层析获得较高纯度的酶，克服了原核表达量低，纯化复杂的问题。

为了实现上述目的，本发明采取如下技术方案：

利用大肠杆菌原核表达系统生产小麦蛋白质二硫键异构酶的方法，包括如下步骤：

（1）从小麦幼叶中提取小麦总RNA，通过RT-PCR获取小麦蛋白质二硫键异构酶基因，将此基因连接到PMD-19T载体上，从T载体上克隆的目的基因经酶切后，插入到载体质粒PET-30b中，酶切位点分别为BamH I和Xho I，构建出表达蛋白质二硫键异构酶基因的质粒PET30b-wPDI；

（2）将质粒PET30b-wPDI转入大肠杆菌BL21感受态细胞中，得到重组大肠杆菌；将重组大肠杆菌接种于LB培养基中进行摇瓶培养，当菌液OD值达到0.6-0.8时，在低温条件下用0.5mM IPTG诱导6-7小时后，4℃离心收集菌体细胞；

（3）用超声破碎法冰浴裂解细胞，除去不溶性细胞碎片，收集上清液；将上清液过Ni-sepharose亲和层析柱，经梯度洗脱得到带有组氨酸标签的蛋白质二硫键异构酶。

为了获得高效并可溶的表达，目的基因的表达去掉信号肽部分，引物的设计在不改变氨基酸序列的情况下进行了三处碱基突变，并在目的片段C端和N端分别带入His标签；引物序列为5’-CGGATCCAGAGGAAGCCGCAGCCG-3’，5’-CCTCGAGGAGCTCGTCCTTCAGAG-3’。

所述RT-PCR中所用引物序列为：5’-ATGGCGATCTGCAAGGTCTGG-3’,5’-TCAGAGCTCGTCCTTCAGAGGC-3’。