[发明专利]一种空肠弯曲菌快速检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于快速检测空肠弯曲菌DNA存在的荧光定量PCR（聚合酶链式反应）检测试剂盒，适用于定性或定量检测空肠弯曲菌DNA的存在。 

背景技术

 空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)是引起胃肠道感染细菌性肠炎最常见的食源性病原体之一，是一种螺旋状、多形态性、微需氧的革兰阴性菌,为常见的人兽共患病原菌,多数家禽、家畜携带此菌,在其肠道内寄生,粪便或屠宰后的肠内容物散布于周围环境中,进而污染肉类或其他食品，造成食物中毒。可引起急性胃肠炎,也可导致心内腊炎、关节炎、败血症和血栓静脉等全身性疾病,还与人的急性感染性多发性神经根神经病,即格林巴利综合征的发生有密切关系。近年来, 空肠弯曲菌感染的高发生率及其相关疾病的危害已经引起了广泛的关注。目前空肠弯曲菌检验仍以传统的培养法为主，但操作繁琐，耗时长, 需4-5 d 时间，才能最后确定是否为空肠弯曲菌, 因此影响食物中毒的快速诊断和处理。随着分子生物学技术的发展,PCR 技术广泛应用于细菌的快速诊断，然而传统PCR 技术易污染, 造成检测结果的假阳性。1996 年美国应用生物系统公司（ABI）推出荧光定量PCR仪，实现了PCR从定性到定量的飞跃。由于其具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点迅速成为了分子生物学研究中的重要工具。目前,该项技术已被应用于病原体测定、肿瘤基因检测、免疫分析、基因表达、突变及其多态性的研究等多个领域。因此，应用荧光定量PCR技术开发一种用于快速检测空肠弯曲菌的试剂盒是十分必要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快且通量高的空肠弯曲菌荧光定量PCR检测试剂盒，与传统的细菌培养方法和生化鉴定相比，具有更加省时、操作简便和定量准确等优点。

本发明主要包括试剂盒的组成和使用方法。

空肠弯曲菌荧光定量PCR检测试剂盒包括：（1）DNA提取液，（2）PCR反应预混液，（3）热启动Taq 酶，（4）阳性标准品，（5）阴性质控品；

具体的说：

（1）DNA提取液

DNA提取液包含：10mM  Tris-HCl，1mM  EDTA ，pH=8.0，体积分数为10%的Chexe-100。

（2）PCR反应预混液

PCR反应预混液包括PCR反应缓冲成分（50mM KCl，10mM Tris-HCl ，pH 8.5），各400μmol/L的上游引物hipO-1和下游引物hipO-2，200μmol/L荧光探针hipO-3，5mmol/L的MgCl₂，4mmol/L的dNTPs（dATP，dGTP，dCTP和dTTP等体积混合物）和无菌双蒸水；

hipO-1序列为：5＇- CCTCACTAGCAAAATCCACAGCTT- 3＇，

hipO-2序列为：5＇- TGCACAGGCTAATGATATAGRGATTA- 3＇（R=A/G），

hipO-3序列为：5＇- TATTCATAGTCACTGGTGCAAC- 3＇，其中5＇标记FAM基团，3＇标记MGB基团。

（3）热启动Taq 酶

热启动Taq 酶的浓度为5U/ul，每反应体系加入1U。

（4）阳性标准品

阳性标准品是空肠弯曲菌特异性马尿酸酶(hippurate hydrolase ，hipO)基因中部分核酸片段连接到T载体上构建的质粒，该质粒在大肠杆菌中繁殖后，经纯化，可以用紫外分光光度法测定浓度后，稀释到10⁶拷贝/μL, 即为阳性标准品。

连接到T载体上的hipO基因核酸片段的序列为：

CCTCACTAGCAAAATCCACAGCTTCATCGTTATTCATAGTCACTGGTGCAACAACATTTTTATTGATTTTAATCCCTATATCATTAGCCTGTGCA。

（5）阴性质控品

阴性质控品为无菌双蒸水。

 

本试剂盒的使用方法包括以下步骤：

（1）样品处理及DNA提取；

（2）配制PCR反应液；

（3）在PCR反应液中分别加入样本DNA提取，阴性质控品和阳性标准品；

（4）进行PCR扩增；

（5）对荧光PCR结果进行分析。

本试剂盒和传统的培养法比较，具有以下优势：