[发明专利]用于检测铬离子的间接竞争酶联免疫试剂盒及其组建和检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及酶联免疫和铬离子检测领域，特别是涉及一种用于检测铬离子的酶联免疫试剂盒及其组建和检测方法。

背景技术

铬是自然界中广泛存在的一种元素，分布于土壤、大气、水及生物体中，主要以三价铬（Cr³⁺）和六价铬（Cr⁶⁺）的形式存在。铬是人和动物体必须微量元素之一，Cr³⁺具有葡萄糖耐量因子（GTF）的活性，参与调节生物体内胆固醇和糖代谢作用，Cr³⁺缺乏会使机体血管内壁的脂肪产生沉积而导致动脉硬化。但Cr³⁺和Cr⁶⁺又是毒性物质，Cr⁶⁺的毒性是Cr³⁺毒性的100倍，许多研究证实，Cr³⁺具有致癌性和诱发基因突变的毒性作用；Cr⁶⁺具有致癌毒性、黏膜毒性、肝肾毒性。因此，我国《生活饮用水卫生标准》规定饮用水中铬离子含量不得超过50ng/mL，食品铬含量（GB14961-94）粮食食品不超过1000ng/mL，果蔬食品不超过500ng/mL，动物性食品肉蛋不超过1000ng/mL，铬离子是食品安全监管的重点对象。

由于铬具有良好的性能，在电镀、电池、汽车、航空、颜料、油漆、印刷、塑料等行业中发挥着重要作用，铬环境污染日趋严重，对人体健康的危害也愈来愈大，铬污染超标事件屡有发生，已成为环境污染的公害之一。2011年8月，曲靖铬渣污染事件，地下水的出水口检测出的六价铬含量超标200多倍；2012年4月，铬超标药用胶囊事件造成经济损失达160余亿元。

目前，已建立的食品铬检测技术主要有石墨炉原子吸收光谱法（GFAAS）、火焰原子吸收光谱法（FAAS）、电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）、电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-AES）、氢化物发生-原子荧光光谱法（HG-AFS）、电化学分析法等，但这些理化分析方法需要昂贵的仪器设备和熟练的专业人员，检测烦琐费时、周期长，费用高，不能现场操作，样品筛检量小等，其应用受到了限制。

因此，研制快速、简便、敏感、特异、经济、筛检量大的铬离子快速检测技术，对于减少环境污染、提高食品质量、保障食品安全具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题：提供一种能够快速、简便、敏感、特异的检测铬离子的酶联免疫试剂盒；

还提供了该酶联免疫试剂盒的组建方法以及检测方法。

本发明的技术方案：

一种用于检测铬离子的间接竞争酶联免疫试剂盒，包括盒体，盒体内设有用三价铬离子包被抗原包被过的酶标板、抗三价铬离子的单克隆抗体、酶标二抗、底物显色液、终止液、三价铬离子标准溶液、洗液浓缩液、样品处理液。

所述的三价铬离子包被抗原是由以下方法制备的：

 （1）称取10 mg异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸鳌合剂ITCBE溶于 1mL二甲基亚砜DMSO形成金属鳌合剂溶液；称取18.1 mg CrCL₃·6H₂O溶于1 mL浓度为10 mmol/L、pH值为8.0的HEPES缓冲液中，形成Cr³⁺溶液；将金属鳌合剂溶液和Cr³⁺溶液混合，并用NaOH调节pH值至7.0，然后在室温下放在摇床上反应12 h，即形成Cr³⁺-ITCBE鳌合物半抗原溶液；

（2）称取20 mg 卵清蛋白OVA溶于1 mL浓度为0.1 mol/L、pH值为8.0的HEPES缓冲液中，形成载体蛋白溶液；

（3）取1 mL Cr³⁺-ITCBE鳌合物半抗原溶液加入到1 mL载体蛋白溶液中，并用NaOH调节pH值至9.0，室温摇床反应24 h，然后移入透析袋中透析5天，收集透析液，即形成包被抗原Cr³⁺-ITCBE-OVA，收集分装，－20℃冻存备用。

所述酶标板按如下方法包被：包被抗原为Cr³⁺-ITCBE-OVA，包被浓度为2 μg/mL，包被溶液为0.05 moL/L pH 9.6的碳酸盐缓冲液，包被剂量为100 μL/孔，37 ℃温育2 h或室温8 h，用洗液浓缩液PBST洗涤3次，用5%的猪血清封闭，每孔250 μL，37 ℃温育1 h，再用PBST洗涤3次；所述洗液浓缩液PBST为0.01 mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液，其中含0.05%的Tween-20。