[发明专利]用于检测铬离子的间接竞争酶联免疫试剂盒及其组建和检测方法

权利要求书

1.一种用于检测铬离子的间接竞争酶联免疫试剂盒，包括盒体，其特征是：盒体内设有用三价铬离子包被抗原包被过的酶标板、抗三价铬离子的单克隆抗体、酶标二抗、底物显色液、终止液、三价铬离子标准溶液、洗液浓缩液、样品处理液。

2.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征是：所述的三价铬离子包被抗原是由以下方法制备的：

 （1）称取10 mg异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸鳌合剂ITCBE溶于 1mL二甲基亚砜DMSO形成金属鳌合剂溶液；称取18.1 mg CrCL₃·6H₂O溶于1 mL浓度为10 mmol/L、pH值为8.0的HEPES缓冲液中，形成Cr³⁺溶液；将金属鳌合剂溶液和Cr³⁺溶液混合，并用NaOH调节pH值至7.0，然后在室温下放在摇床上反应12 h，即形成Cr³⁺-ITCBE鳌合物半抗原溶液；

（2）称取20 mg 卵清蛋白OVA溶于1 mL浓度为0.1 mol/L、pH值为8.0的HEPES缓冲液中，形成载体蛋白溶液；

（3）取1 mL Cr³⁺-ITCBE鳌合物半抗原溶液加入到1 mL载体蛋白溶液中，并用NaOH调节pH值至9.0，室温摇床反应24 h，然后移入透析袋中透析5天，收集透析液，即形成包被抗原Cr³⁺-ITCBE-OVA，收集分装，－20℃冻存备用。

3.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述酶标板按如下方法包被：包被抗原为Cr³⁺-ITCBE-OVA，包被浓度为2μg/mL，包被溶液为0.05 moL/L pH 9.6的碳酸盐缓冲液，包被剂量为100 μL/孔，37 ℃温育2 h或室温8 h，用洗液浓缩液PBST洗涤3次，用5%的猪血清封闭，每孔250 μL，37 ℃温育1 h，再用PBST洗涤3次；所述洗液浓缩液PBST为0.01 mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液，其中含0.05%的Tween-20。

4.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述的抗三价铬离子单克隆抗体是按以下方法制备的：

制备免疫抗原：称取10 mg异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸鳌合剂ITCBE溶于1mL二甲基亚砜DMSO形成金属鳌合剂溶液；称取18.1 mg CrCL₃·6H₂O溶于1mL浓度为10 mmol/L、pH值为8.0的HEPES缓冲液中，形成Cr³⁺溶液；将金属鳌合剂溶液和Cr³⁺溶液混合，并用NaOH调节pH值至7.0，然后在室温下放在摇床上反应12 h，形成Cr³⁺-ITCBE鳌合物半抗原溶液；称取20 mg牛血清白蛋白BSA溶于1 mL浓度为0.1 mol/L、pH值为8.0的HEPES缓冲液中，形成载体蛋白溶液；取1 mL Cr³⁺-ITCBE鳌合物半抗原溶液加入到1 mL载体蛋白溶液中，并用NaOH调节pH值至9.0，室温摇床反应24 h，然后移入透析袋中透析5天，收集透析液，即形成免疫抗原Cr³⁺-ITCBE-BSA，收集分装，－20℃冻存备用；

免疫动物：以Cr³⁺-ITCBE-BSA为免疫抗原，以Balb/c小鼠作为免疫动物，背部皮下多点注射，免疫剂量为每只每次50～100 μg，首免用弗氏完全佐剂，加强免疫用弗氏不完全佐剂，首免后3周进行第二次免疫，以后间隔2周免疫，共免疫5次；

选择细胞融合备用小鼠：间接ELISA法检测抗血清中Cr³⁺螯合物多克隆抗体的效价，阻断ELISA法检测Cr³⁺-EDTA多克隆抗体对Cr³⁺-EDTA的半数抑制浓度IC₅₀，挑选效价最高、IC₅₀最低的小鼠，超免用于细胞融合；

制备阳性杂交瘤细胞：取NS0骨髓瘤细胞与免疫小鼠脾细胞用PEG进行细胞融合，经过四次有限稀释法亚克隆，获得稳定分泌抗三价铬离子单克隆抗体的细胞株；

制备单克隆抗体：对经产母鼠腹腔注射杂交瘤细胞株，采集腹水纯化，获得抗三价铬离子的单克隆抗体。