[发明专利]一种具有致痒作用的芋蛋白提取物及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种致痒工具药物，具体涉及一种从天南星科植物芋中分离得到的具有致痒活性的蛋白提取物，属于生物医药技术领域。

背景技术

痒是一种不愉快的感受，可引起搔抓欲望或搔抓反射，是独立于痛觉之外的一种伤害性感受，它是皮肤病、自身免疫性疾病、某些药物副作用的典型症状，是一种慢性疾病，严重影响人们的生活质量，困扰人类达数千年之久。

临床治疗和日常生活中，痒的发生非常普遍，但对痒产生的病理、生理学机制知之甚少。芋是天南星科植物芋Colocasia esculenta(L.)S.的块茎，又称芋头、芋艿、芋魁、土芝，多年生块茎植物，营养价值高，是非洲和亚洲的中国、日本、印度、菲律宾等地区重要农作物。然而芋作为食物必须做熟才能食用，否则有毒。《名医别录》谓之“辛，平，有毒”，在处理生品时不能擦、敷到健康皮肤，否则会引起皮炎，主要症状是局部皮肤红肿，瘙痒。

钙离子是机体的重要元素，同时作为细胞内第二信使通过与钙调蛋白（Calmodulin,CaM）结合激活多种蛋白激酶(如腺苷酸环化酶，磷酸二酯酶，钙调蛋白激酶等)及诸多蛋白水解酶和核酸酶，从而参与细胞代谢，细胞周期等多种细胞功能的调节，在细胞的许多生命活动中担当者重要的角色。神经细胞中钙离子浓度的动态变化可以反映神经细胞的兴奋性，因此在实验中可以用于推测致痒相关神经元的兴奋状态。

GCaMP小鼠是经过钙调蛋白（CaM），绿色荧光蛋白（GFP）和平滑肌细胞肌球蛋白轻链激酶片段M13融合重组构建成的转基因小鼠。小鼠的背根节神经元（DRG）上表达出的三种蛋白有如下关系：受体未被激动时，胞外钙离子浓度低，钙调蛋白保持原始构相，GFP发光蛋白包裹在融合泛白的内部，在激发光的激发下，显示微弱的光；当受体被药物激动时引起神经元兴奋，胞外钙离子浓度增加，与钙调蛋白结合，引起钙调蛋白构象的改变，而使GFP发光蛋白暴露在融合蛋白的表面，激发光激发时，荧光的亮度明显增加。通过比较钙离子结合和未结合状态下荧光的亮度分析细胞中钙离子的浓度变化，进而确定药物致痒活性。

发明内容

发明目的：本发明的目的是在对芋现有研究的基础之上，通过实验筛选，采用现代生化技术手段，对芋中致痒活性成分进行跟踪评价，通过超滤、凝胶色谱法、离子交换色谱法等分离纯化方法制备得到一种具有致痒作用的蛋白提取物，实验结果表明该蛋白提取物具有很好的致痒作用，可作为模型工具药使用。

技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：

一种具有致痒作用的芋蛋白提取物，它的氨基酸序列为：

Ser-Gln-Leu-Asn-Phe-Tyr-Gln-Gly-Lys-Gly-Gln-Gly-Asn-Phe-Leu-Val-Ala-Val-Asp（丝氨酸-谷氨酰胺-亮氨酸-天冬酰胺-苯丙氨酸-酪氨酸-谷氨酰胺-甘氨酸-赖氨酸-甘氨酸-谷氨酰胺-甘氨酸-天冬酰胺-苯丙氨酸-亮氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸-天冬氨酸）。氨基酸序列表如序列表1。

本发明提供的具有致痒作用的芋蛋白提取物，其分子量约为9300Da，通过质谱分析，具有与Lectin OS=Colocasia esculenta PE=4SV=1-[A5HMM7_COLES]（A5HMM7）相同的肽段LTLTDYGELVIKNGDGSTVWR和GNYAAVLHPDGRLVVFGPSVFK，与凝集素具有同源性。本发明提供的芋蛋白提取物能诱导GCaMP小鼠DRG神经元细胞荧光增强，兴奋部分DRG神经元，具有很好的致痒活性。

本发明所述的具有致痒作用的芋蛋白提取物的制备方法，其包括以下步骤：

(1)将新鲜的芋头切块，加1～3倍水后，匀浆机粉碎，按固液比为1:3～1:8加入乙醇，搅拌浸泡1～6小时，过滤，滤渣常温下挥干乙醇后，按固液比为1:3～1:8加水，匀浆机粉碎，纱布过滤，得到滤液；

(2)取步骤(1)滤液用超滤系统进行分级，所用滤膜截留分子量分别为3000Da和10000Da，分别得到小于3000Da、3000-10000Da和大于10000Da三个分子量段的芋头蛋白粗提液，使用钙离子成像实验检测致痒活性，得到分子量段为3000-10000Da具有致痒活性的提取物；

(3)取步骤(2)所得的具有致痒活性的提取物于0～10℃，转速1000～8000rpm下进行离心分离，取上清液，经离子交换柱层析，柱层析填料为强阴离子交换树脂，用水与NaCl溶液为流动相，梯度洗脱，用钙离子成像实验检测致痒活性，收集有致痒活性的组分；