[发明专利]一种制备重组柯萨奇病毒A16型病毒样颗粒的方法

说明书

技术领域

本发明涉及免疫技术领域，具体涉及一种制备重组柯萨奇病毒A16型病毒样颗粒的方法。

背景技术

手足口病是一种主要由肠道病毒引起的威胁5岁以下低龄儿童健康的病毒性传染病，主要感染途径为粪-口传播。症状包括发热和手、足、口腔等部位的皮疹、溃疡，少数患儿可出现心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎、急性迟缓性麻痹、神经源性肺水肿等并发症，个别病情进展较快的重症患儿会导致死亡。手足口病已在世界多个国家引起爆发性流行，尤其近几年的大规模爆发流行及死亡率明显升高。中国最早的手足口病报道于上世纪80年代初，而爆发性流行始于2007年。自2008年5月起，中国将其规定为法定报告管理的丙类传染病。根据卫生部（http://www.moh.gov.cn/publicfiles/business/htmlfiles/wsb/）统计，2008-2011年中国手足口病发病及死亡人数急速增长，自2008年开始，中国的手足口病疫情呈现了不可控的爆发性流行，发病人数及死亡人数明显上升，2010年的发病人数近180万，而2007年的时候仅8万多，仅仅3年手足口病的发病人数就增长了20倍，如此可怕的增长趋势不得不引起卫生部门的极大重视，如何预防和治疗手足口病是中国政府必须在短期内克服的一大公共卫生难题。

手足口病可由20多种肠道病毒感染引起，其中以肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒（Coxsackievirus，CV）A组16型的感染率和发病率最高,其他较常见的引起手足口病的肠道病毒还包括CV A组2、4、5、7、9、10型，CV B组1、2、3、4、5、13型，埃可病毒。

柯萨奇病毒发现于20世纪中叶，在纽约市柯萨奇镇的一次脊髓灰质炎病毒流行中，通过乳鼠分离的方法首次成功分离出具有不同血清型的多种柯萨奇病毒，根据病毒对乳鼠的致病性将它们分为A、B两组。柯萨奇病毒感染孕妇可导致流产、胎儿心肌炎和新生儿神经系统发育迟缓；婴儿感染柯萨奇病毒可导致心肌炎、脑膜炎、脑炎，死亡率可高达10%。

目前已发现至少30种血清型的CV，A组24种，B组6种，其中A组16型（Coxsackievirus A16，CA16）与EV71并列成为了引起手足口病的最主要的病原体。CA16轻症患者临床症状与EV71引起的手足口病难以区别，需要通过特异性的检测手段（RT-PCR或ELISA）明确病原体。通常认为CA16感染引发的症状相较EV71感染而言较轻，并发症较少，大多可在5～7天内自愈，但近年来许多报道都显示CA16感染同样可以导致严重的并发症，甚至死亡。

与其他血清型的肠道病毒类似，CA16的病毒颗粒直径约为20～30nm，呈现20面体对称球形，无包膜。病毒衣壳蛋白内部包裹着一条单股正链RNA，全长约7410核苷酸，由一个开放阅读框（open reading frame，ORF）和两端的5’，3’非编码区（untranslated region，UTR）组成。ORF编码一个较大的多聚前体蛋白，由P1、P2、P3三个前体蛋白组成，P1编码病毒的结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4，其中VP1包含主要的中和抗原表位所在的区域，VP1和VP4常作为CA16的基因型鉴别依据。每个成熟的CA16病毒颗粒包含60个亚基，每个亚基分别由一拷贝的VP1、VP2、VP3、VP4组成。P2、P3编码非结构蛋白，包括2A、2B、2C、3A、VPg（3B）、3C和3D。2A、3C是特异性蛋白水解酶，主要负责自裂解P1、P2、P3前体蛋白，VPg是病毒基因组RNA的5’末端结合蛋白，3D是RNA聚合酶。

肠道病毒家族的前体蛋白的剪切过程比较复杂，不过大多都大同小异，以脊髓灰质炎与EV71为例，ORF表达的多聚前体蛋白首先裂解为P1、P2、P3，继而再进一步经2A、3C和病毒RNA等的作用裂解为各种衣壳蛋白亚基和非结构功能蛋白。

手足口病是全球性的流行病，无明显的地区性，即可散发流行，也可爆发性流行。总体而言，夏秋季为高发季节。多种肠道病毒感染都可以导致手足口病，不过主要病原体是CA16和EV71。

很多病毒的病毒结构蛋白重组表达后可以自发组装成病毒样颗粒，该病毒样颗粒的抗原性与真病毒没有区别，但缺少病毒核酸因而不具有感染性。病毒样颗粒已经成为开放安全有效的病毒性疾病疫苗的一个有效策略，因此，针对柯萨奇病毒CA16的病毒样颗粒的有效制备是生产手足口病疫苗的有效途径。

发明内容