[发明专利]利用美丽鸡血藤非胚性细胞悬浮培养生产牛大力多糖的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用美丽鸡血藤非胚性细胞悬浮培养生产牛大力多糖的方法。

背景技术

美丽鸡血藤为豆科蝶形花亚科鸡血藤属多年生藤状灌木植物，分布于热带和亚热带地区。其膨大的根（药材名：牛大力）为野生名贵南药。牛大力始载于《生草药性备要》，近代本草中多有收载，是多种中成药的主要原料。牛大力具有补肺滋肾、清热止咳、舒筋活络等功效,主治肺虚咳嗽、咳血、肾虚、腰膝酸痛、遗精、白带、风湿痹痛、跌打损伤、慢性肝炎等。此外，牛大力在两广、海南被广泛用做煲汤、药膳、药酒的原料，具有调节肺、脾、肾三脏功能和增强机体抗病能力的功效。

多糖是多种中草药的有效成分之一，在保健食品中作为添加剂也有广泛应用，同时作为为广谱免疫调节剂在日常洗化用品比如沐浴露、润肤霜等中添加。牛大力多糖是牛大力的主要有效成分之一,具广泛的生物活性。和众多重要中草药多糖一样，牛大力多糖被发现具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤的功效，是一种高效的、多功能的天然抗氧化剂和自由基清除剂。目前，牛大力多糖的生产原料主要依靠挖掘野生美丽鸡血藤植物资源获得，而利用悬浮培养的细胞作为牛大力多糖来源的尚未见报道。

利用悬浮细胞系生产植物功能性次生代谢产物已在1000多种植物上有过相关研究，可以有效的生产各种天然化合物，如生物碱、蛋白质、糖类、药物、香料天然色素以及其他活性产物。并且已有众多成功的例子，例如，紫杉醇、紫草宁、迷迭香酸和人参皂甙已经具备工业化生产技术。在细胞系的选择上，可以利用单细胞或细胞团进行培养，其中单细胞体系具在细胞类型的一致性、生长周期的稳定性、生长高效等方面的优势。

美丽鸡血藤植物种质资源由于长期不合理的采挖已经遭到严重破坏，在我国仅剩零星分布，资源几近枯竭。在自然条件下，牛大力一般三到五年后有块根形成，但有的牛大力种质栽培3年仍不见根系膨大，面对在医药、药膳、药酒、食品添加剂、化妆品、保健品等方面庞大的市场，原材料明显不足。并且，在人工栽培过程中，日照、水肥、土壤条件等多种因素制约其块根的膨大。

目前，传统获取牛大力多糖的方法是通过挖取野生美丽鸡血藤膨大的块根加工而成，或者人工种植的美丽鸡血藤。但是，前者已经导致野生美丽崖豆藤资源几近枯竭，而后者，采用人工种植的方法，由于该植物生长周期较长，需要长时间占用大量耕地，并且产量和品质受到自然条件和人工栽培技术的影响，牛大力多糖的产量和品质难以保证。所以，用细胞培养的方法来生产牛大力多糖，是未来的一种发展方向。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种利用美丽鸡血藤非胚性细胞悬浮培养生产牛大力多糖的方法，该方法具有生产周期短、不占用耕地、产量稳定、有效成分含量高、不破坏自然资源的特点。

本发明上述所要解决的技术问题是通过如下技术方案来实现的：一种利用美丽鸡血藤非胚性细胞悬浮培养生产牛大力多糖的方法，含以下步骤：

（1）取美丽鸡血藤外植体，在愈伤诱导培养基上进行培养，获得非胚性愈伤组织；

（2）将步骤（1）中获得的非胚性愈伤组织在愈伤增殖培养基上进行增殖培养，获得生长迅速疏松的细胞团；

（3）将步骤（2）获得的细胞团接种至细胞悬浮启动培养基中培养，获得液体培养的具有轴性分裂特征的非胚性悬浮细胞系；

（4）将步骤（3）获得的非胚性悬浮细胞系离心沉淀后，取沉淀接种至液体增殖培养基中，获得生长周期稳定、生长迅速的悬浮细胞，该悬浮细胞为适合于提取牛大力多糖的非胚性悬浮细胞系；

（5）取步骤（4）获得的悬浮细胞，水提取1～3次，合并提取液，在提取液中加水无水乙醇至溶液中乙醇的体积百分含量为60～75%，取上清液，旋蒸后，获得牛大力粗多糖。

本发明步骤（1）中所述的美丽鸡血藤外植体培养前优选经含切段和消毒工序等处理。

本发明所述的美丽鸡血藤外植体优选为美丽鸡血藤的幼茎。

本发明所述幼茎长度优选为1～2cm，优选含有1～2个腋芽。

本发明步骤（1）中所述的愈伤诱导培养基配方优选为：MS培养基+蔗糖20～40g/L+6-BA1～3mg/L+NAA0.1～1mg/L+0.8～1.2%琼脂，pH为5.55～5.95，培养温度为24～28℃，光照强度2000～4000Lux，每日光照时长为8～12小时，培养时间为25～35天。