[发明专利]利用美丽鸡血藤非胚性细胞悬浮培养生产牛大力多糖的方法

权利要求书

1.一种利用美丽鸡血藤非胚性细胞悬浮培养生产牛大力多糖的方法，其特征是含以下步骤：

（1）取美丽鸡血藤外植体，在愈伤诱导培养基上进行培养，获得非胚性愈伤组织；

（2）将步骤（1）中获得的非胚性愈伤组织在愈伤增殖培养基上进行增殖培养，获得生长迅速疏松的细胞团；

（3）将步骤（2）获得的细胞团接种至细胞悬浮启动培养基中培养，获得液体培养的具有轴性分裂特征的非胚性悬浮细胞系；

（4）将步骤（3）获得的非胚性悬浮细胞系离心沉淀后，取沉淀接种至液体增殖培养基中，获得生长周期稳定、生长迅速的悬浮细胞，该悬浮细胞为适合于提取牛大力多糖的非胚性悬浮细胞系；

（5）取步骤（4）获得的悬浮细胞，水提取1～3次，合并提取液，在提取液中加水无水乙醇至溶液中乙醇的体积百分含量为60～75%，取上清液，旋蒸后，获得牛大力粗多糖。

2.根据权利要求1所述的利用美丽鸡血藤非胚性细胞悬浮培养生产牛大力多糖的方法，其特征是：步骤（1）中所述的美丽鸡血藤外植体培养前经含切段和消毒工序处理。

3.根据权利要求2所述的利用美丽鸡血藤非胚性单细胞悬浮培养生产牛大力多糖的方法，其特征是：所述的美丽鸡血藤外植体为美丽鸡血藤的幼茎。

4.根据权利要求3所述的利用美丽鸡血藤非胚性单细胞悬浮培养生产牛大力多糖的方法，其特征是：所述幼茎长度为1～2cm，含有1～2个腋芽。

5.根据权利要求1所述的利用美丽鸡血藤非胚性细胞悬浮培养生产牛大力多糖的方法，其特征是：步骤（1）中所述的愈伤诱导培养基配方为：MS培养基+蔗糖20～40g/L+6-BA1～3mg/L+NAA0.1～1mg/L+0.8～1.2%琼脂，pH为5.55～5.95，培养温度为24～28℃，光照强度2000～4000Lux，每日光照时长为8～12小时，培养时间为25～35天。

6.根据权利要求1所述的利用美丽鸡血藤非胚性细胞悬浮培养生产牛大力多糖的方法，其特征是：步骤（2）中所述的愈伤增殖培养基配方为：MS培养基+蔗糖20～40g/L+6-BA3～4mg/L+Picloram0.5～1mg/L+0.8%琼脂，pH为5.65～5.85，培养温度为25～28℃，培养方式为暗培养，培养周期为28～35天，非胚性愈伤组织接种大小为0.125～0.25cm³，经过一个培养周期，非胚性愈伤组织体积增加6～10倍。

7.根据权利要求1所述的利用美丽鸡血藤非胚性细胞悬浮培养生产牛大力多糖的方法，其特征是：步骤（3）中所述的细胞悬浮启动培养基配方为：MS培养基+蔗糖18～22g/L+6-BA0.25～1mg/L+Picloram0.5～2mg/L，pH为5.65～5.85；培养温度为24～27℃，培养方式为暗培养，培养周期为10天，接种量为细胞悬浮启动培养基体积的1/10～1/20，120～150rpm回旋式震荡培养。

8.根据权利要求1所述的利用美丽鸡血藤非胚性细胞悬浮培养生产牛大力多糖的方法，其特征是步骤（4）中所述的液体增殖培养基配方为：MS培养基+蔗糖25～35g/L+6-BA0.5～2mg/L+Picloram0.5～4mg/L，pH5.65～5.85，培养温度为24～27℃，暗培养，120～150rpm回旋式震荡培养，培养7～10天获得稳定的非胚性悬浮细胞系，稳定后的非胚性悬浮细胞系生长周期为10天，继代周期为7～10天，继代时接种量为增殖培养基体积的1/6～1/10。

9.根据权利要求1所述的利用美丽鸡血藤非胚性细胞悬浮培养生产牛大力多糖的方法，其特征是：步骤（5）中水提取时的温度为95～100℃，提取时间为40～80min。

10.根据权利要求1所述的利用美丽鸡血藤非胚性单细胞悬浮培养生产牛大力多糖的方法，其特征是：步骤（5）中旋蒸时的温度为48～55℃。