[发明专利]一种表达IL12的多顺反子慢病毒载体及其制备与应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种表达IL12的多顺反子慢病毒载体、慢病毒颗粒，以及其制备与应用。

背景技术

慢病毒(Lentivirus)是逆转录病毒科(Retrovirus)的一个亚科,是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别于一般的逆转录病毒载体，它可以感染分裂细胞及非分裂细胞。慢病毒作为外源基因表达载体有以下优点，慢病毒载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达；转移基因片段容量较大；目的基因表达时间长；不易诱发宿主免疫反应等。慢病毒克服了其它逆转录病毒载体的一些缺陷,因而成为最理想的基因转移载体之一，为基因功能的研究提供了更强有力的工具。

口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus,FMDV)属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属（Peter W Mason,Marvin J Grubman,Barry Baxt.Molecular basis of pathogenesis of FMDV.Virus Research.2003;1(91):9-32.）。FMDV基因组编码的蛋白酶2A可在翻译过程中形成的高级结构对核糖体肽基转移酶中心造成空间位阻，导致无法形成正常的肽链连接，但同时核糖体却能继续翻译下游蛋白，从而形成一种类似蛋白水解酶的作用将前后两个蛋白顺式“切开”。剪切位点位于高度保守的“NPGP”序列的“G”和“P”之间。2A则由于其独特的“剪切”机制，导致最终，2A能起到类似蛋白水解酶的作用，在该位点将一个启动子控制下的氨基酸序列顺式“切开”，分别得到一个融合有2A多肽尾巴的上游蛋白和一个N端带有一个脯氨酸的下游蛋白，独立行使功能。故FMDV 2A自我剪切序列与内部核糖体进入位点（IRES）一样都被应用于多顺反子表达载体的构建，以达到独立表达两段非融合外源蛋白的目的。与IRES相比，FMDV 2A在多顺反子载体构建上有明显的优势，比如，FMDV 2A因结构比较短小对插入的多顺反子序列的容量无苛刻要求，且2A元件所连接的上下游基因的表达平衡性好。这些多顺反子表达系统与不同的病毒载体结合被应用于多种疾病的基因治疗。

白细胞介素-12（IL12）是能够调控固有及适应免疫反应的多活性细胞因子（Grufman P,K rre K.Innate and adaptive immunity to tumors:IL-12 is required for optimal responses.Eur J Immunol.2000;30:1088-1093.），主要来源于单核/巨噬细胞、抗原递呈细胞和B细胞，是由相对分子质量为40×10³（p40）和35×10³（p35）两个亚单位经二硫键连接形成的异二聚体糖蛋白，p35和p40两个亚基单独存在时无生物学活性，只有两个亚基以1:1比例结合获得的p70蛋白才具有功能作用（Gubler U,Chua AO,Schoenhaut DS,et al.Coexpression of two distinct genes is required to generate secreted bioactive cytotoxic lymphocyte maturation factor.Proc Natl Acad Sci U S A.1991；88:4143-4147.）。IL-12的受体IL-12R由β1链和β2链构成(D.Sieburth,E.W.Jabs,J.A.Warrington,X.Li,et al.Assignment of genes encoding a unique cytokine(IL12)composed of two unrelated subunits to chromosomes 3 and 5.Genomics.1992；14（1）：59-62.)，有多种存在形式，与IL-12有很高的亲和力。p40与IL-12 β2链结合，介导p35与β1链结合，后者发挥生物活性。IL-12R存在于激活的T细胞以及静息或激活的NK细胞上，B细胞和静息的T细胞则没有IL-12R表达。IL12的生物学活性表现在其能够促进被激活T细胞的增殖，CD4T细胞向辅助效应Th1细胞的分化及CD8T细胞向CTL细胞的分化。另外，IL12能够增强NK细胞的细胞杀伤活性，并刺激NK细胞和T细胞分泌IFN-γ(Trinchieri G.Interleukin-12 and the regulation of innate resistance and adaptive immunity.Nat Rev Immunol2003；3:133-146.)。IL-12还能够平衡Th1/Th2的应答。IL-12直接激活Th1并抑制Th2；IL-12还可以诱导NK细胞和T细胞产生IFN-γ间接调节Th1/Th2的应答平衡(Manetti R,Parronchi P,Giudizi MG,et al.Natural killer cell stimulatory factor(interleukin 12[IL-12])induces T helper type 1(Th1)-specific immune responses and inhibits the development of IL-4-producing Th cells.J Exp Med.1993;177:1199-1204.)。在一些临床肿瘤模型中，IL12疗法能够实现原发肿瘤的消退，抑制肿瘤的远端转移，并且延长荷瘤小鼠的寿命(Noguchi Y,Jungbluth A,Richards EC,et al.Effect of interleukin 12 on tumor induction by 3-methylcholanthrene.Proc Natl Acad Sci USA.1996;93:11798-11801.Brunda MJ,Luistro L,Warrier RR,et al.Antitumor and antimetastatic activity of interleukin 12 against murine tumors.J Exp Med.1993;178:1223-1230.)。