[发明专利]一种基于腺病毒AdC7的表达载体及其构建方法

说明书

本发明涉及一种基于腺病毒AdC7的表达载体及其构建方法。本发明人设计了一种有效的策略，成功地基于黑猩猩型腺病毒AdC7构建成一种新型表达载体。所述的疫苗载体可应用于制备可高效表达且具有良好免疫原性的病毒疫苗。

技术领域

本发明属于生物技术和病毒学领域；更具体地，本发明涉及一种基于腺病毒AdC7的表达载体及其构建方法。

背景技术

重组腺病毒载体具有高转导效率、表达水平高、持续时间长、易于纯化等特点，并且免疫后可诱导外源基因特异性的细胞免疫与体液免疫反应，因此是一种理想的疫苗载体。基于腺病毒人血清型2型(AdHu2)与5型(AdHu5)的表达载体在疫苗研究以及基因治疗中曾被广泛应用，但由于人群中40-60%的个体已经感染相应的腺病毒，存在相应的预存中和抗体，从而限制AdHu2和AdHu5载体的临床应用。为克服预存中和抗体的影响，一种方法是改造AdHu2和AdHu5载体的衣壳蛋白。一些研究显示，可通过交换纤维蛋白基因来实现这一想法。但是这种嵌合病毒仍会被针对hexon表位的抗体所中和，而且一些hexon蛋白经改造后的嵌合病毒不稳定；另一种方法是选择人稀有血清型或来源于其它动物宿主的腺病毒作为表达载体。由于人群中一般不会含有抗黑猩猩型腺病毒的中和抗体，因此基于黑猩猩型腺病毒的疫苗载体，其免疫效果显著优于以人血清型腺病毒构建的疫苗载体。目前，基于黑猩猩型腺病毒的新型疫苗载体成为疫苗研发中重要选择。2013年5月，比尔盖兹基金会(Bill&Melinda Gates Foundation)资助美国、英国以及瑞士的研究单位(公司)2900万美元，用于新型黑猩猩腺病毒载体的研发。

构建重组腺病毒载体的方法有三种。传统的方法是在包装细胞系中进行外源基因和野生型病毒的同源重组，从而获得重组腺病毒，但这种方法操作复杂，费时费力，不容易获得单一的重组腺病毒；第二种方法是基于在大肠杆菌中同源重组，其缺点是相对费时，容易发生突变。第三种方法是将腺病毒基因组直接克隆到质粒载体上，然后线性化转染包装细胞系，拯救出腺病毒。由于腺病毒基因组相对较大，大小约为36kb，对其基因组进行直接克隆存在一定难度。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于腺病毒AdC7的表达载体及其构建方法。

在本发明的第一方面，提供一种制备腺病毒表达载体的方法，所述方法包括：以野生型腺病毒AdC7基因组(较佳地，序列如GenBank登录号AY530878.1)为基础，删除部分E1编码区与全部E3编码区，在E1删除区增添I-Ceu I与PI-Sce I酶切位点，在E3删除区增添RsrII酶切位点，获得复制缺陷型的重组腺病毒表达载体。

在一个优选例中，所述的删除部分E1编码区是指删除野生型AdC7基因组中第458-3026位(基于GenBank登录号AY530878.1的序列计算序列位点)的序列。

在另一优选例中，所述的删除全部E3编码区是指删除野生型AdC7基因组中第27094-31799位(基于GenBank登录号AY530878.1的序列计算序列位点)的序列。

在另一优选例中，所述的方法包括：

(1)将来源于pNEB193的origin序列、来源于AdC7腺病毒基因组的LITR片段、来源于AdC7腺病毒基因组的Nde I-Age I片段通过融合PCR融合成片段OLN，用Spe I与Age I酶切片段OLN；用Nde I、Age I与Spe I酶切AdC7腺病毒基因组，将切下的片段Age(4028)-SpeI(10610)(基于GenBank登录号AY530878.1的序列计算序列位点)与已酶切过的片段OLN相连接形成质粒pOIN；

(2)用Hind III和Avr II酶切AdC7基因组，将切下的目的片段Hind III(7153)-Avr II(23363)插入到质粒pOIN的Hind III和Avr II位点中，获得的质粒命名为pOINH(基于GenBank登录号AY530878.1的序列计算序列位点)；