[发明专利]一种基于腺病毒AdC7的表达载体及其构建方法

权利要求书

1.一种制备腺病毒表达载体的方法，其特征在于，所述方法包括：

以GenBank登录号AY530878.1所示的野生型腺病毒AdC7基因组为基础，删除部分E1编码区与全部E3编码区，在E1删除区增添I-Ceu I与PI-Sce I酶切位点，在E3删除区增添RsrII酶切位点，获得复制缺陷型的重组腺病毒表达载体；

其中，所述的删除部分E1编码区是指删除野生型AdC7基因组中第458-3026位的序列；所述的删除全部E3编码区是指删除野生型AdC7基因组中第27094-31799位的序列；

其中，所述的方法包括：

(1)将SEQ ID NO:1中第1-1882位所示的origin序列、来源于AdC7腺病毒基因组的LITR片段、来源于AdC7腺病毒基因组的Nde I-Age I片段通过融合PCR融合成片段OLN，用Spe I与Age I酶切片段OLN；用Nde I、Age I与Spe I酶切AdC7腺病毒基因组，将切下的片段Age-SpeI与已酶切过的片段OLN相连接形成质粒pOIN；

(2)用Hind III和Avr II酶切AdC7基因组，将切下的目的片段Hind III-Avr II插入到质粒pOIN的Hind III和Avr II位点中，获得的质粒命名为pOINH；

(3)从AdC7腺病毒基因组中扩增位于AdC7腺病毒基因中31800-36535之间的片段，在5’端引入Avr II与Rsr II酶切位点，在3’端引入Pac I与Asis I位点，将扩增的片段插入到pOINH的Avr II与Asis I位点中，获得的质粒命名为pOINHR；和

(4)从AdC7腺病毒基因组中扩增位于AdC7腺病毒基因中23165-27093之间的片段，在3’端引入Rsr II位点，将扩增的片段插入到pOINHR的Avr II与Rsr II位点中，获得复制缺陷型的重组腺病毒表达载体。

2.一种腺病毒表达载体，其特征在于，所述表达载体在GenBank登录号AY530878.1所示的野生型腺病毒AdC7基因组基础上删除部分E1编码区与全部E3编码区，并且，在E1删除区增添I-Ceu I与PI-Sce I酶切位点，在E3删除区增添Rsr II酶切位点；

其中，所述的删除部分E1编码区是指删除野生型AdC7基因组中第458-3026位的序列；所述的删除全部E3编码区是指删除野生型AdC7基因组中第27094-31799位的序列；

所述腺病毒表达载体通过以下方法制备：

(1)将SEQ ID NO:1中第1-1882位所示的origin序列、来源于AdC7腺病毒基因组的LITR片段、来源于AdC7腺病毒基因组的Nde I-Age I片段通过融合PCR融合成片段OLN，用Spe I与Age I酶切片段OLN；用Nde I、Age I与Spe I酶切AdC7腺病毒基因组，将切下的片段Age-SpeI与已酶切过的片段OLN相连接形成质粒pOIN；

(2)用Hind III和Avr II酶切AdC7基因组，将切下的目的片段Hind III-Avr II插入到质粒pOIN的Hind III和Avr II位点中，获得的质粒命名为pOINH；

(3)从AdC7腺病毒基因组中扩增位于AdC7腺病毒基因中31800-36535之间的片段，在5’端引入Avr II与Rsr II酶切位点，在3’端引入Pac I与Asis I位点，将扩增的片段插入到pOINH的Avr II与Asis I位点中，获得的质粒命名为pOINHR；和

(4)从AdC7腺病毒基因组中扩增位于AdC7腺病毒基因中23165-27093之间的片段，在3’端引入Rsr II位点，将扩增的片段插入到pOINHR的Avr II与Rsr II位点中，获得复制缺陷型的重组腺病毒表达载体。

3.如权利要求2所述的腺病毒表达载体，其特征在于，所述表达载体的酶切位点PI-SceI和I-Ceu I之间，还包括外源的抗原编码基因。

4.如权利要求3所述的腺病毒表达载体，其特征在于，所述的外源抗原是流感病毒的血凝素抗原。