[发明专利]应用于小麦成熟胚培养的干胚游离方法

说明书

技术领域

本发明涉及应用于小麦成熟胚培养的干胚游离方法。

背景技术

小麦是我国的重要粮食作物，与国家粮食安全、国民经济发展、社会稳定和人民生活水平的提高有着密切的关系。近年来，农业生物技术的飞速发展为小麦遗传育种研究提供了新的动力，其中小麦转基因技术为开展小麦的基因组研究和遗传改良开辟了广阔的前景。

小麦转基因技术的最重要的基础是小麦组培体系的建立及完善。小麦组培体系的外植体源主要有幼胚、花药、顶端分生组织、幼穗、成熟胚等，其中小麦幼胚的愈伤组织诱导和再生能力较高，是目前公认的最好的外植体源之一。幼胚的获取有一个严重的局限性，即受小麦生长季节及环境条件的影响，这给小麦遗传转化研究带来了众多不便。为了有效地克服以上不足，以小麦成熟胚作为组织培养的外植体越来越受到广大研究者的欢迎，小麦成熟胚还具有取材方便、保存期长、个体间生理状况相似，可大量获得等优点，更加有利于小麦转基因研究的进行。

采用成熟胚进行转基因操作，最初采用剥取完整胚直接接种的方法，其再生效果很差、再生率较低、大多数基因型不能得到再生植株。后来逐步研究并发现了胚乳支撑接种法、成熟胚切割接种法以及成熟胚刮碎接种法（刮胚法）等，胚性愈伤形成率及再生频率得到了一定的提高。其中刮胚法的再生效果最好，是目前公认的常规方法。以上前人的接种方法均是对在种子进行消毒后，在超净台一粒粒的对浸泡过夜种子的胚进行剥取并接种，其操作繁琐，容易污染，耗费时间及劳动力。

发明内容

本发明的目的是提供用于一种应用于小麦成熟胚培养的干胚游离方法。

本发明提供了一种禾本科植物取胚方法，包括如下步骤：将禾本科植物的籽粒(未经浸泡处理的籽粒，或称干燥的籽粒)打碎(打碎程度以大多数颗粒的粒度介于9目筛和30目筛之间为准)，先过9目网筛去除大颗粒，再过30目网筛去除小颗粒，从粒度介于9目筛和30目筛之间的颗粒中挑取1-2mm的胚组织（淡黄色，形状似月牙，约占破碎组织的40%左右）。

所述禾本科植物具体可为小麦，如小麦品种“辽春18号”。

本发明还保护所述方法在制备禾本科植物的愈伤组织中的应用。

本发明还保护一种制备禾本科植物的愈伤组织的方法，包括如下步骤：

（1）将禾本科植物的籽粒(未经浸泡处理的籽粒，或称干燥的籽粒)打碎(打碎程度以大多数颗粒的粒度介于9目筛和30目筛之间为准)，先过9目网筛去除大颗粒，再过30目网筛去除小颗粒，从粒度介于9目筛和30目筛之间的颗粒中挑取胚组织（淡黄色，形状似月牙，大小为1-2mm，约占破碎组织的40%左右）；

（2）将步骤（1）得到的胚组织用水洗涤，然后用2.5g/100ml次氯酸钠水溶液消毒1分钟，然后用水洗涤；

（3）将权利要求（2）得到的胚组织接种至诱导培养基并进行暗培养，得到愈伤组织。

所述禾本科植物具体可为小麦，如小麦品种“辽春18号”。

本发明还保护所述方法在禾本科植物的遗传转化中的应用。

本发明还保护一种制备转基因禾本科植物的方法，包括如下步骤：

（1）将禾本科植物的籽粒(未经浸泡处理的籽粒，或称干燥的籽粒)打碎(打碎程度以大多数颗粒的粒度介于9目筛和30目筛之间为准)，先过9目网筛去除大颗粒，再过30目网筛去除小颗粒，从粒度介于9目筛和30目筛之间的颗粒中挑取胚组织（淡黄色，形状似月牙，大小为1-2mm，约占破碎组织的40%左右）；

（2）将步骤（1）得到的胚组织用水洗涤，然后用2.5g/100ml次氯酸钠水溶液消毒1分钟，然后用水洗涤；

（3）将权利要求（2）得到的胚组织进行愈伤诱导培养（具体可在诱导培养基中25℃暗培养1周），得到愈伤组织；

（4）将步骤（3）得到的愈伤组织进行高渗培养（具体可在高渗培养基中25℃暗培养4-6小时），然后用基因枪轰击携带目的基因的重组表达载体，然后进行恢复培养（具体可在恢复培养基中25℃暗培养1周）；

（5）取完成步骤（4）的愈伤组织，采用0.75mg/L草甘膦进行筛选培养（具体可在含0.75mg/L草甘膦的筛选基础培养基中，25℃、光照12小时/黑暗12小时的条件下培养1周），然后在0.75mg/L草甘膦浓度下进行分化培养（具体可在含0.75mg/L草甘膦的分化基础培养基中，25℃、光照12小时/黑暗12小时的条件下培养一个月）；