[发明专利]肽组合物的修饰以提高稳定性和递送效率

说明书

本申请是国际申请号PCT/US2008/051706，国际申请日2008年1月22日，进入中国国家阶段日期为2009年9月16日，中国申请号200880008559.1，发明名称为“肽组合物的修饰以提高稳定性和递送效率”的分案申请。

技术领域

本申请涉及用于提高生物活性试剂的载体进入活组织细胞的组合物和方法。所述组合物和方法包括与修饰的tat肽缀合的PKC调节肽，所述修饰的tat肽为所述缀合物赋予提高的血浆稳定性，允许更有效地吸收PKC调节肽进入细胞。

背景技术

研究已经产生了许多具有作为治疗性组合物的潜力的肽。然而，由于多种原因，尚未获得实现和利用针对细胞内靶标的肽的全部治疗性潜力。其中最重要的一个原因是大部分治疗性肽不具有穿过细胞膜到达它们的治疗靶标的能力。对该问题的一种解决方案是使用作用为运送货物(cargo)肽进入靶细胞的载体肽。

存在许多有效促进货物肽穿过靶细胞膜的载体肽的著名实例。一个实例是来源于HIV病毒TAT蛋白的肽序列。参见，美国专利号6,316,003，其通过引用完全结合于此。另一种公知的载体肽序列是“聚-Arg”序列。参见，例如，美国专利号6,306,993。

在许多情形中，利用二硫键连接载体和货物肽而产生治疗性肽构建体是解决使可溶肽靶向细胞内靶标的问题的有效策略。解释二硫键的用途的一种理论认为，一旦载体-货物构建体进入靶细胞，这两种肽可以通过二硫键还原而分离。与保留所述载体-货物连接的其它连接机制相反，在细胞内环境中的这种分离可以允许货物肽在细胞内更好的扩散。然而，在这一点上，治疗性肽的施用仍然遇到许多挑战，诸如二硫键交换，蛋白水解降解和细胞吸收的效率。指导控制这些问题的方法应该增加治疗性肽的稳定性和功效。

一种提高包括以二硫键与货物肽键合的载体肽的治疗性肽的功效的方法是减少二硫键交换。二硫键交换通过允许一个载体肽将其货物肽换成另一个载体肽而减少给定样品中的载体-货物肽构建体的量，由此导致产生载体-载体构建体和货物-货物构建体。仅有载体的构建体将不具有治疗作用。所述货物-货物构建体将具有急剧减少的治疗作用，如果不是完全消除的作用的话，因为所述载体肽能够将所述货物递送至其细胞内靶标。同样地，控制二硫键交换的问题对于使载体-货物肽构建体的治疗潜力最大化非常重要。

使用治疗性肽所面对的另一个问题是蛋白水解降解。肽是众所周知的不稳定分子，并且在施用给受试者时经常容易受到蛋白水解攻击而分解。在施用时降解的不稳定的载体肽将减少或者甚至消除所述货物肽的功效，因为所述货物依赖于所述载体肽到达细胞内靶标。因此，控制或消除治疗性肽的不稳定的性质的方法对于最大化载体-货物肽的治疗潜力也是重要的。

提高治疗性肽的细胞吸收效率是可能减少治疗性肽的功效或潜力的另一个问题。针对货物肽最优化载体肽的序列和位置提供用于提高治疗性肽构建体的稳定性和潜力的方法。

发明内容

本公开的发明涉及制备包括载体肽和PKC活性调节货物肽的治疗性肽组合物的方法，由此形成的治疗性肽组合物相对于未修饰的治疗性肽具有提高的稳定性和潜力。本发明的一个实施方案是减少治疗性肽组合物中的二硫键交换的方法，所述方法包括提供这样的治疗性肽组合物，所述治疗性肽组合物包括包含第一半胱氨酸残基的载体肽和包含第二半胱氨酸残基的PKC活性调节货物肽，其中所述载体肽和所述货物肽通过在所述第一和第二半胱氨酸残基之间的半胱氨酸-半胱氨酸二硫键连接；和引入至少一个紧邻所述第一或第二半胱氨酸残基、或两者的脂族残基，由此二硫键交换率相对于未修饰的治疗性肽组合物减少。

本公开的发明的另一个实施方案涉及减少治疗性肽组合物的蛋白水解降解的方法，所述方法包括提供这样的治疗性肽组合物，所述治疗性肽组合物包括载体肽和PKC活性调节货物肽，并且其中所述载体肽与所述货物肽连接；确定在所述载体肽、货物肽、或这两种肽上的蛋白水解不稳定位点；和修饰在所述不稳定位点的氨基酸序列，以便使所述位点处的蛋白水解降解率相对于未修饰的治疗性肽组合物而减少。

本公开的发明的另一个实施方案涉及提高治疗性肽组合物的血浆稳定性的方法，所述方法包括提供这样的治疗性肽组合物，所述治疗性肽组合物包括载体肽和PKC活性调节货物肽，并且其中所述载体肽与所述货物肽连接；修饰所述载体肽、货物肽、或二者的氨基端、羧基端或两端的残基，以便所述治疗性肽组合物的血浆稳定性相对于未修饰的治疗性肽组合物得到提高。