[发明专利]通过荧光定量PCR检测转基因小麦生长期内根际土壤中荧光假单胞菌数量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及农作物生防菌的分子检测技术，属于生物技术领域。

背景技术

农业生物技术应用服务组织（ISAAA）数据显示，到2012年，种植转基因作物的国家已经达到29个，并且全球转基因作物的种植面积也已经达到15亿公顷。^.转基因作物与日俱增的种植面积，主要还是由于其带来的丰厚经济效益，但这样大范围的扩增对整个农业种植环境到底有无影响成为一个迫在眉睫的问题，所以对于其对农业生产的生态环境的考量也就显得尤为重要。

荧光假单胞菌 (Pseudomonas fluorescens)在分类学上属于细菌域、变形菌门、γ-变形菌纲、假单胞菌目、假单胞菌科的假单胞菌属。细胞为直的杆菌，大小为0.7-0.8X2.3-2.8 微米，不产芽孢，革兰氏染色阴性。有数根极生鞭毛，运动。需氧,进行严格的呼吸型代谢,以氧为最终电子受体。能以硝酸盐为替代的电子受体进行厌氧呼吸。化能营养异养，不需要有机生长因子。氧化酶阳性，接触酶阳性。能利用葡萄糖和果糖，有些菌株能从蔗糖合成果聚糖，明胶液化。生长温度范围 4-37℃，最适生长温度是25-30℃。 DNA中G+C 含量是60-61%。广泛分布于自然界，如土壤、水、植物及动物活动环境中。该菌生化能力活跃，可降解许多人工合成化合物，常被用于环境保护。

荧光假单胞菌还是一种重要的植物根际促生细菌,是已知植物根际有益微生物中种群数量较多的细菌种类之一。该菌营养需要相对简单,能够利用根系分泌物中大部分营养迅速在植物根围定殖。其中一些菌株具有促进植物生长和防治病害的作用,因而用于植物病害的生物防治。

 荧光假单胞菌是一种在根际土壤中很容易分离得到的一个菌种，并且其特性被认为可以快速直观的反应整个土壤环境的变化，由此通过对荧光假单胞的数量变化的检测，就可以较为准确的说明转基因小麦对其根系土壤环境有无影响。

目前人们对土壤样品中荧光假单胞菌的检测方法主要是通过分离培养菌株然后通过生理生化或分子生物学进行鉴定，这种方法只能针对特定时间的特定土壤进行分析，虽能也分离得到荧光假单胞菌但并未对其数量进行确定，不能反映整个土壤环境在植物生长期间的变化，并未形成针对植物生长期间对土壤中荧光假单胞菌变化规律进行检测的体系。

实时荧光定量PCR 技术是一种利用核酸进行定量的方法，发明人曾于2011年12月15日申请了利用该技术检测转基因小麦生长期内根际土壤中镰刀菌拷贝数，并获得了专利权，授权公告号为：CN102517385B，该专利告诉我们，它能够重复的，灵敏的，特异的对目标真菌进行定量，结果也较为准确，较普通的定量方法快捷有效。但是，能否用于对转基因小麦生长期内根际土壤中的细菌进行检测，并没有任何启示，此前的公开报道和论文也没有相关的报道。

发明内容

本发明的目的在于：对转基因小麦根际土壤中荧光假单胞菌含量的绝对定量方法进行了研究，旨在建立对转基因小麦根际土壤中荧光假单胞菌数量进行定量的荧光定量PCR的方法，为后续对小麦各个生长时期检测做准备工作，进而研究转基因小麦对根际土壤微生物动态的影响。

近年来，荧光定量PCR技术的提出，为土壤中微生物检测提供了全新的方法，和普通PCR 方法相比，具有敏感性高、特异性强、重复性好、成本低、操作方便和直观等优点，它可以通过检测病原菌目的序列PCR扩增产物的荧光信号强度达到实时解析的目的。

本发明的目的是这样实现的：一种通过实时荧光定量PCR建立转基因小麦生长期内根际土壤中荧光假单胞菌数量的方法，其特征在于：利用荧光假单胞菌gyrB为目的基因设计的特异引物S EQ ID No.1和SEQ ID No.2对转基因小麦根际土壤样本的总DNA进行PCR扩增，获得大小在151bp的特异性片段，具体步骤如下：

a）在田间播种转基因小麦，设置四个重复。分别在小麦生长发育的播种期、拔节期、灌浆期、成熟期采用对角线5点取样法采集根际土壤样本；