[发明专利]通过荧光定量PCR检测转基因小麦生长期内根际土壤中荧光假单胞菌数量的方法

权利要求书

1. 建立应用荧光定量PCR方法检测转基因小麦根际土壤中荧光假单胞菌(Psdeuomnoda fluoerncnet)数量的检测体系,其特征在于：利用荧光假单胞菌gyrB为目的基因设计的特异引物SEQ ID No.1和SEQ ID No.2对转基因小麦根际土壤样本的总DNA进行PCR扩增，获得大小在151bp的特异性片段，具体步骤如下：

a）在田间播种转基因小麦，设置四个重复；分别在小麦生长发育的播种期、拔节期、灌浆期、成熟期采用对角线5点取样法采集根际土壤样本；

b）应用UltraClean^TM soil DNA Isolation Kit试剂盒（Mo-Bio，USA）分别提取转基因小麦根际土壤样本的总DNA，并将该样本的总DNA溶于ddH₂O中；以荧光假单胞菌gyrB为目的基因设计的特异引物S EQ ID No.1和SEQ ID No.2，对每个时期的样本DNA进行PCR扩增，获得大小在151bp的特异性片段；并进行克隆测序，分析得到阳性克隆后提取质粒，构建标准曲线；由实时荧光定量PCR仪时根据荧光信号的变化及标准曲线直接测出土壤中荧光假单胞菌拷贝数；

c）应用定量PCR引物SEQ ID No.1和SEQ ID No.2进行荧光定量扩增，将不同时期土壤样本中荧光假单胞菌拷贝数汇总，形成转基因小麦生长期内根际土壤中荧光假单胞菌拷贝数变化趋势；

所述的标准曲线为Y₁=-3.320X₁+38.843，R²=0.99905，其中Y₁为实时荧光定量PCR反应的Ct值，X₁为荧光假单胞菌的标准质粒拷贝数对数值。

2.根据权利要求1所述的通过实时荧光定量PCR建立转基因小麦生长期内根际土壤中荧光假单胞拷贝数的方法，其特征在于：PCR反应的体系为：20μL，其中10×PCR Buffer10 μL，其中包括2×Master Mix，上、下游引物10μmol/L各0.5μL，模板1μL，再加去离子水补足；实时荧光定量PCR反应程序为：95℃预变性5 min; 95℃变性10 s，55℃退火20s，72℃延伸20s，共进行40个循环。