[发明专利]一种用于磁共振示踪肿瘤细胞的诊断剂

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于磁共振示踪肿瘤细胞的诊断剂。

发明背景

研究表明端粒酶催化亚单位即人端粒酶逆转录酶，简称为“hTERT”，在绝大多大数人肿瘤细胞和永生化细胞内表达阳性，而在正常体细胞内为阴性，与端粒酶活性具有一致性，是肿瘤细胞的特异性标志物。因此，hTERT的启动子可以调控基因靶向性表达于端粒酶阳性的肿瘤细胞内，而且其启动子是目前已知最广谱的肿瘤细胞特异性启动子。

报告基因显像技术主要是将分子生物学和显像技术结合，实现靶分子的非侵入性显像。铁蛋白基因是磁共振成像(MRI）中最受关注的报告基因之一，不需引入外源性对比剂即可实现显像。磁共振成像技术临床应用广泛，成像分辨率高，可同时获得解剖和功能信息，铁蛋白是机体主要的储铁蛋白，可将摄取的铁离子聚集在蛋白壳内，形成具有超顺磁性的氧化铁颗粒，因此，应用铁蛋白报告基因实现MR显像的方法成为了焦点之一。

本发明人研究发现，基因的表达受到启动子的调控，所以通过检测基因表达情况能间接反映启动子的转录活性，但是，需通过提取细胞或组织进行免疫染色、蛋白印迹等侵入性手段来检测启动子驱动基因表达后带来的效应。因此，应用非侵入性手段对端粒酶逆转录酶启动子的转录活性进行检测成像具有重要肿瘤学意义。应用hTERT启动子调控铁蛋白报告基因过表达的载体感染细胞，然后进行MR成像，使用MR铁蛋白报告基因成像技术可以非侵入性检测活体肿瘤细胞。

发明内容

本发明的目的提供了一种用于磁共振示踪肿瘤细胞的诊断剂，包含人端粒酶逆转录酶启动子、铁蛋白报告基因、慢病毒载体、包装质粒和包装细胞。

上述本发明的用于磁共振示踪肿瘤细胞的诊断剂，人端粒酶逆转录酶启动子和铁蛋白报告基因插入慢病毒载体，人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子调控铁蛋白报告基因在慢病毒载体内表达,并通过载体质粒，传染给肿瘤细胞过表达，所述铁蛋白报告基因为带有flag标签蛋白序列的铁蛋白重链全基因，所述包装质粒为pCD/NL-BH*DDD和pLTR-G，所述包装细胞为293T。

在一实施方案中，本发明的用于磁共振示踪肿瘤细胞的诊断剂，包含人端粒酶逆转录酶启动子、铁蛋白报告基因、慢病毒载体、包装质粒和包装细胞，其中，人端粒酶逆转录酶启动子和铁蛋白报告基因插入慢病毒载体，人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子调控铁蛋白报告基因在慢病毒载体内表达,并通过载体质粒，传染给肿瘤细胞过表达。

在上述实施方案中，本发明的用于磁共振示踪肿瘤细胞的诊断剂，所述铁蛋白报告基因为带有flag标签蛋白序列的铁蛋白重链全基因，所述包装质粒为pCD/NL-BH*DDD和pLTR-G，所述包装细胞为293T。

本发明的另一目的提供了一种制备用于磁共振示踪肿瘤细胞的诊断剂的方法，包括以下步骤：

1）根据Genbank（基因库）代号为NM_010239的铁蛋白重链（Fth）基因序列信息人工合成目的基因并接入flag标签蛋白序列，在其两端引入限制性内切酶NheI和BamHI识别位点，利用DNA连接酶将所述蛋白序列克隆入慢病毒（pCDH-CMV-MCS-Puro）载体质粒,得到pCDH-CMV-Fth-flag-Puro慢病毒载体；

2）用Spe I和Xba I对步骤1）的慢病毒载体进行双酶切，酶切产物电泳后回收无CMV的载体片段；

3）从含hTERT的质粒中PCR扩增hTERT启动子片段重组入步骤2）的无巨细胞病毒(CMV)的载体片段构建成目的pCDH-hTERT-Fth-flag-Puro慢病毒载体；

4）对步骤3）的pCDH-hTERT-Fth-flag-Puro慢病毒包装，采用pCD/NL-BH*DDD和pLTR-G包装质粒，293T包装细胞，构建成Lenti-hTERT-Fth-flag-Puro慢病毒表达载体，即得诊断剂。

术语“肿瘤细胞”在本发明中没有特别指明的情况下是指恶性肿瘤细胞。

本发明的再一目的提供了一种检测肿瘤细胞的方法，将本发明的用于磁共振示踪肿瘤细胞的诊断剂与肿瘤细胞接触，将人端粒酶逆转录酶启动子和铁蛋白报告基因传染给肿瘤细胞过表达，用MRI扫描示踪肿瘤细胞。