[发明专利]猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒多重RT-PCR检测引物及试剂

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒多重RT-PCR检测引物及试剂。

背景技术

猪瘟（Classical swine fever, CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus, CSFV）引起的一种急性、高度接触性传染病，当前以由B型毒株引起的慢性（或非典型）猪瘟为最常见病型。该病临床表现和病理变化不典型，易造成种猪持续性感染，引起母猪带毒综合征，并且可造成所产仔猪产生免疫耐受，这是当前规模化猪场猪瘟持续存在的重要原因。猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiration syndrome，PRRS），又称“猪蓝耳病”，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiration syndrome virus，PRRSV）引起主要以母猪出现繁殖障碍和仔猪呼吸障碍为主要特征的传染病。自2006年以来，我国大部分地区发生“猪高热病”，相继有报道从发病猪体内分离到了PRRSV高致病性毒株（HP-PRRSV），基因序列分析结果表明该流行毒株在nsp2基因的N-末端有30个氨基酸缺失，这是高致病性毒株特征。由于PRRSV经典毒株和高致病性毒株的防控策略不同，所以两种毒株的鉴别诊断具有非常重要意义。PRRS和CSF都是严重危害世界养猪业的主要病毒性传染病，二者极易发生混合感染和继发感染（如PRV、PCV-2、链球菌、副猪嗜血杆菌等），这不但给猪病病原体之间的鉴别诊断增加困难，也使猪病日趋复杂化，死亡率升高，严重影响养猪生产。

由于RT-PCR方法同其他病原学检测方法比较具有快速、敏感性高和特异性优点而广泛用于CSFV和PRRSV的检测。虽然目前一些CSFV和PRRSV的RT-PCR试剂盒已经在临床上应用，但都为单项RT-PCR方法，即检测CSFV、PRRSV经典毒株和PRRSV高致病性毒株需要3种试剂盒，操作3次，费时费力，同时检测费用也较高。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术缺陷，本发明之目的就是提供一种猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒多重RT-PCR检测引物及试剂，可有效解决猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒多重RT-PCR检测的问题。

本发明的技术方案是，本发明提供一种猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒多重RT-PCR检测引物：包括引物对C1/C2和P1/P2，引物对C1/C2包括引物C1和引物C2，引物对P1/P2包括引物P1和引物P2，引物C1、引物C2 、引物P1和引物P2的核苷酸序列分别为序列表的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；

所述的引物对C1/C2和P1/P2在对CSFV细胞毒、PRRSV细胞毒和HP-PRRSV细胞毒基因组RNA进行RT-PCR扩增后得到CSFV PCR产物294bp SEQ ID NO:7、PRRSV PCR产物536bp SEQ ID NO:5和HP-PRRSV PCR产物452bp SEQ ID NO:6。

本发明的另一目的还提供一种猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒多重RT-PCR检测试剂：包括反转录体系试剂和PCR体系试剂，所述的反转录体系试剂包括待测RNA模板、引物C2、引物P2、dNTP mixture（脱氧核糖核苷三磷酸，以下同）、RNA酶抑制剂、M-MLV反转录酶和5×M-MLV buffer；所述的引物C2（25μM）和P2（25μM）在反转录体系试剂中均为2μL；所述的RNA酶抑制剂（40U/μL）在反转录体系试剂中为1μL，购自宝生物工程（大连）公司，货号2313A；所述的dNTP mixture（各2.5mM）在反转录体系试剂中为5 μL，购自宝生物工程（大连）公司，货号D4030RA；所述的M-MLV反转录酶（200U/μL）和5×M-MLV buffer在反转录体系试剂中分别为1μL和5μL，购自宝生物工程（大连）公司，货号2641A；