[发明专利]一种采用睾丸酮丛毛单胞菌高效生产羟基类固醇脱氢酶的方法

权利要求书

1.一种采用睾丸酮丛毛单胞菌高效生产羟基类固醇脱氢酶的方法，其特征在于包含如下步骤：

配制LB培养基：将10克蛋白胨，5克酵母浸粉和5克氯化钠不分前后顺序投入到1000毫升水中，PH值自然，搅拌溶解后分装于多个直径25mm，长度200mm的试管中，每个试管中装5毫升，将所述多个试管放医用消毒器中，采用0.12-0.14兆帕灭菌20分钟；

接种：在无菌条件下打开冻干管睾丸酮丛毛单胞菌种，然后向所述冻干管睾丸酮丛毛单胞菌种里面加入以上灭好菌的LB培养基1毫升，摇动溶化后制得冻干管菌悬液备用，然后取上面灭好菌的培养基5毫升，在无菌条件下打开试管，并向试管中加入所述冻干管菌悬液0.3毫升，重新将试管密封好，放摇瓶机中摇动制得扩大菌种液；

一级种子培养：

一级种子培养基配方中各组分的重量百分比为：

酵母浸粉0.15%—0.25% 蛋白胨  0.25%—0.45%   氯化钠 0.1%—0.3%    

植物甾醇0.01%—0.15% 维生素D3  0.01%—0.15%  硫酸铵0.25%—0.5%

余量为水                 PH值自然

将所述一级种子培养基配方中的各原料不分前后顺序的加入所述一级种子培养基配方的水中，开动搅拌机搅拌制得一级种子培养液；将所述一级种子培养液量取所用量加入到三角瓶中，封口后灭菌，将装有经过灭菌的培养液的三角瓶放超静工作台中降温，当温度降到27-31℃时，在无菌条件下将所述培养好的扩大菌种液接到三角瓶中去，100毫升一级种子培养液接入的扩大菌种液为2毫升，完毕后放摇瓶机中，制得一级菌种液；

将发酵设备的管道、无菌空气过滤系统进行灭菌处理，以及将种子罐及发酵罐进行空罐灭菌处理；

种子罐培养：

种子罐培养基配方中各组分的重量百分比为：

酵母浸粉0.1%—0.4%     蛋白胨0.2%—0.5%     氯化钠0.15%—0.3%

植物甾醇0.1%—0.3%     维生素D3 0.02%—0.2%  硫酸铵0.2%—0.6%

余量为水                PH值自然

将所述种子罐培养基配方中的各原料不分前后顺序的加入所述种子罐培养基配方的水中，经过高温灭菌及降温处理后，将所述培养好的一级菌种液在无菌条件下接种到经灭菌处理的种子罐中，100公斤种子罐培养基接入所述一级菌种液的量为1公斤，然后盖好罐上的接种帽，通过无菌通风培养制得种子罐菌种液；

发酵罐培养：

发酵罐培养基配方中各组分的重量百分比为：

酵母浸粉0.1%—0.3%   蛋白胨0.15%—1.5%     氯化钠0.1%—0.5%

植物甾醇0.1%—0.4%   维生素D3 0.01%—0.1%  硫酸铵0.2%—0.7%

维生素E 0.01%—0.15%  余量为水              PH值自然

首先将所述发酵罐培养基配方中的水投入到经灭菌处理的发酵罐中，然后开动搅拌机，向发酵罐中不分前后顺序的加入所述发酵罐培养基配方中的各原料，经过高温灭菌及降温处理后，接入菌种，开始发酵培养；

羟基类固醇脱氢酶的破壁提取：

首先采用管式离心机，8000-16000转/每分钟，控制流量每小时1000公斤，弃上清，收集湿菌体；然后将收集的湿菌体按1公斤湿菌体加水3-10公斤，搅拌均匀制成菌悬液，再加入总重量为0.01-0.1%的溶菌酶和0.02-0.2%的蜗牛酶，在4℃—35℃的条件下搅拌1小时，然后放入-40℃冰冻，直至结冰冻实为止，取出后溶化冰，然后再放入-40℃结冰，这样反复3-6次即可达到破壁提取所述羟基类固醇脱氢酶的最佳效果。

2.如权利要求1所述的采用睾丸酮丛毛单胞菌高效生产羟基类固醇脱氢酶的方法，其中所述扩大菌种液是在27-31℃的温度下，采用150-210转/分钟的转速，在摇瓶机中摇动8-40小时制得。